PCR FAQ 1. Odi eke, ko si ẹgbẹ ampilifaya ti o han 2. Idaduro eke 3. Awọn ohun elo ampilifaya ti kii ṣe pato han 4. Flaky fa awọn ila tabi awọn ila smear han:

1Odi eke, ko si ẹgbẹ imudara ti o han Awọn abala bọtini ti iṣesi PCR jẹ

① igbaradi ti acid nucleic awoṣe

② Didara alakoko ati pato

③ didara enzymu ati

④ Awọn ipo ọmọ PCR. Lati wa awọn idi, itupalẹ ati iwadi yẹ ki o tun ṣe lori awọn ọna asopọ loke.

Àdàkọ:

① Awoṣe naa ni awọn ọlọjẹ alaimọ ninu

② Awoṣe naa ni awọn inhibitors enzyme Taq ninu

③ Awọn ọlọjẹ ti o wa ninu awoṣe ko ni digested ati yọkuro, paapaa awọn itan-akọọlẹ ninu awọn chromosomes

④ Pupọ ti sọnu lakoko isediwon ati igbaradi ti awoṣe, tabi phenol ti fa simu

⑤Awoṣe nucleic acid ko jẹ denatured patapata. Nigbati didara awọn enzymu ati awọn alakoko ba dara, ti awọn ẹgbẹ imudara ko ba han, o ṣee ṣe pe ohunkan wa ti ko tọ pẹlu ilana tito nkan lẹsẹsẹ ti apẹrẹ tabi ilana isediwon acid nucleic. Nitorinaa, ojutu tito nkan lẹsẹsẹ ti o munadoko ati iduroṣinṣin gbọdọ wa ni ipese, ati pe ilana naa yẹ ki o wa titi ati pe ko yẹ ki o yipada ni ifẹ. . Aiṣiṣẹ Enzyme: O jẹ dandan lati rọpo henensiamu tuntun, tabi lo mejeeji atijọ ati awọn ensaemusi tuntun ni akoko kanna lati ṣe itupalẹ boya awọn odi eke jẹ nitori pipadanu tabi iṣẹ ṣiṣe enzymu ti ko to. O yẹ ki o ṣe akiyesi pe nigbakanna enzymu Taq ti gbagbe. Awọn alakọbẹrẹ: Didara alakoko, ifọkansi alakoko, ati boya awọn ifọkansi ti awọn alakoko meji jẹ iṣiro jẹ awọn idi ti o wọpọ fun ikuna PCR tabi awọn ẹgbẹ imudara ti ko ni itẹlọrun ati itankale irọrun. Awọn iṣoro wa pẹlu didara iṣelọpọ alakoko ni diẹ ninu awọn ipele. Ọkan ninu awọn alakoko meji naa ni ifọkansi giga ati ekeji ni ifọkansi kekere, ti o mu ki imudara asymmetric ṣiṣẹ kekere.

Awọn igbese counter ni:

① Yan ẹyọ iṣelọpọ alakoko to dara.

② Ifọkansi ti awọn alakoko ko yẹ ki o wo iye OD nikan, ṣugbọn tun san ifojusi si ojutu ọja iṣura alakoko fun agarose gel electrophoresis. Awọn igbohunsafefe alakoko gbọdọ wa, ati imọlẹ ti awọn ẹgbẹ alakoko meji yẹ ki o jẹ aijọju kanna. Fun apẹẹrẹ, alakoko kan ni ẹgbẹ kan ati pe alakoko miiran ko ni iye. Fun awọn ila, PCR le kuna ni akoko yii ati pe o yẹ ki o yanju nipasẹ idunadura pẹlu ẹyọ iṣelọpọ alakoko. Ti alakoko kan ba ni imọlẹ giga ati ekeji ni imọlẹ kekere, dọgbadọgba awọn ifọkansi nigbati o ba diluting awọn alakoko.

③ Awọn alakoko yẹ ki o wa ni ipamọ ni ifọkansi giga ati awọn iwọn kekere lati ṣe idiwọ didi leralera ati thawing tabi ibi ipamọ igba pipẹ ninu firiji, eyiti o le ja si ibajẹ ati ibajẹ awọn alakoko.

④ Awọn apẹrẹ alakoko ko ni imọran, gẹgẹbi ipari ipari ko to, awọn dimers ti wa ni akoso laarin awọn alakoko, bbl Mg2 + ifọkansi: Mg2 + ion fojusi ni ipa nla lori imudara imudara PCR. Ti ifọkansi ba ga ju, o le dinku iyasọtọ ti imudara PCR. Ti ifọkansi ba kere ju, yoo ni ipa lori ikore ampilifaya PCR ati paapaa fa ki imudara PCR kuna laisi awọn ẹgbẹ imudara. Awọn iyipada ninu iwọn didun esi: Nigbagbogbo awọn iwọn didun ti a lo fun imudara PCR jẹ 20ul, 30ul, ati 50ul. Tabi 100ul, iwọn didun wo ni o yẹ ki o lo fun imudara PCR ti ṣeto ni ibamu si awọn idi oriṣiriṣi ti iwadii imọ-jinlẹ ati idanwo ile-iwosan. Lẹhin ṣiṣe iwọn didun kekere, bii 20ul, ati lẹhinna ṣiṣe iwọn didun nla, o gbọdọ tẹle awọn ipo, bibẹẹkọ o yoo kuna ni rọọrun. Awọn idi ti ara: Denaturation ṣe pataki pupọ fun imudara PCR. Ti iwọn otutu denaturation ba lọ silẹ ati akoko denaturation jẹ kukuru, awọn odi eke ni o ṣee ṣe pupọ lati ṣẹlẹ; iwọn otutu annealing ti lọ silẹ pupọ, eyiti o le fa imudara ti kii ṣe pato ati dinku ṣiṣe imudara kan pato. Awọn iwọn otutu annealing ti ga ju. Giga ni ipa lori abuda awọn alakoko si awọn awoṣe ati dinku ṣiṣe imudara PCR. Nigba miiran o jẹ dandan lati lo iwọn otutu thermometer lati ṣayẹwo denaturation, annealing ati awọn iwọn otutu itẹsiwaju ninu ampilifaya tabi ikoko ti omi-omi. Eyi tun jẹ ọkan ninu awọn idi fun ikuna PCR. Iyatọ ọkọọkan ibi-afẹde: Ti ọna ibi-afẹde ba ti yipada tabi paarẹ, eyiti o ni ipa lori abuda kan pato ti alakoko si awoṣe, tabi alakoko ati awoṣe padanu ilana ibaramu nitori piparẹ ti apakan kan ti ọkọọkan ibi-afẹde, imudara PCR kii yoo ṣe aṣeyọri.

2.false positive The PCR ampilifaya iye ti o han ni ibamu pẹlu awọn afojusun ọkọọkan iye, ati ki o ma awọn iye jẹ diẹ létòletò ati imọlẹ. Apẹrẹ alakoko ti ko yẹ: Ọkọọkan imudara ti o yan ni homology pẹlu ọna imudara ti kii ṣe ibi-afẹde, nitorinaa nigbati o ba n ṣe imudara PCR, ọja PCR ti o pọ si jẹ ọna ti kii ṣe ibi-afẹde. Ti ọkọọkan ibi-afẹde ba kuru ju tabi alakoko ti kuru ju, awọn idaniloju eke le waye ni irọrun. Awọn alakoko nilo lati tun ṣe. Agbelebu-kontaminesonu ti awọn ilana ibi-afẹde tabi awọn ọja imudara: Awọn idi meji lo wa fun idoti yii: Ni akọkọ, ibajẹ-agbelebu ti gbogbo genome tabi awọn ajẹkù nla, ti o yori si awọn idaniloju eke. Idaduro eke yii le ṣee yanju nipasẹ awọn ọna wọnyi: Ṣọra ati jẹjẹ nigbati o nṣiṣẹ lati ṣe idiwọ ọkọọkan ibi-afẹde lati fa mu sinu ibon ayẹwo tabi splashed jade kuro ninu tube centrifuge. Ayafi fun awọn enzymu ati awọn nkan ti ko le duro ni awọn iwọn otutu giga, gbogbo awọn reagents tabi ohun elo yẹ ki o jẹ sterilized nipasẹ titẹ giga. Gbogbo awọn tubes centrifuge ati awọn imọran pipette abẹrẹ yẹ ki o lo lẹẹkan. Ti o ba jẹ dandan, awọn tubes ifaseyin ati awọn reagents ti wa ni itanna pẹlu ina ultraviolet ṣaaju ki o to ṣafikun apẹrẹ lati run awọn acids nucleic ti o wa. Èkejì jẹ́ ìbàjẹ́ àwọn àjákù kéékèèké ti àwọn acid nucleic nínú afẹ́fẹ́. Awọn ajẹkù kekere wọnyi kuru ju ọkọọkan ibi-afẹde, ṣugbọn ni awọn isomọ kan. Wọn le pin si ara wọn, ati lẹhin ti o jẹ ibaramu si awọn alakoko, awọn ọja PCR le pọ si, ti o yorisi awọn idaniloju eke, eyiti o le dinku tabi paarẹ nipasẹ awọn ọna PCR itẹ-ẹiyẹ.

 

3.Non-specific amplification bands han Awọn ẹgbẹ ti o han lẹhin imudara PCR ko ni ibamu pẹlu iwọn ti a ti ṣe yẹ, boya o tobi tabi kere si, tabi awọn mejeeji ti o pọju ti o pọju ati awọn ohun elo ti kii ṣe pato ti o han ni akoko kanna. Awọn idi fun hihan awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pato ni: akọkọ, awọn alakoko ko ni ibamu patapata si ọna ibi-afẹde, tabi awọn alakoko kojọpọ lati ṣe awọn dimers. Idi keji ni pe ifọkansi Mg2+ ion ga ju, iwọn otutu annealing ti lọ silẹ pupọ, ati pe nọmba awọn iyipo PCR ga ju. Idi keji jẹ didara ati opoiye ti henensiamu. Awọn enzymu lati diẹ ninu awọn orisun jẹ igbagbogbo si awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pato ṣugbọn awọn enzymu lati awọn orisun miiran kii ṣe. Awọn iye ti awọn enzymu ti o pọ julọ le ma ja si imudara ti kii ṣe pato. Awọn ọna atako pẹlu: tun ṣe awọn alakoko ti o ba jẹ dandan. Din iye henensiamu dinku tabi rọpo rẹ pẹlu orisun miiran. Din iye awọn alakoko dinku, mu iye awoṣe pọ si daradara, ati dinku nọmba awọn iyipo. Mu iwọn otutu annealing pọ daradara tabi lo ọna aaye iwọn otutu meji (denaturation ni 93°C, annealing ati itẹsiwaju ni ayika 65°C).

 

4.Flaky fa tabi smears han PCR ampilifaya ma han bi smeared igbohunsafefe, dì-bi igbohunsafefe tabi capeti-bi iye. Awọn idi nigbagbogbo nfa nipasẹ henensiamu ti o pọ ju tabi didara henensiamu ti ko dara, ifọkansi dNTP ga ju, ifọkansi Mg2+ ti o ga ju, iwọn otutu annealing kekere pupọ, ati ọpọlọpọ awọn iyipo. Awọn wiwọn atako pẹlu: ① Din iye henensiamu ku, tabi rọpo enzymu pẹlu orisun miiran. ②Dinku ifọkansi ti dNTP. Ni deede dinku ifọkansi Mg2+. Ṣe alekun iye awọn awoṣe ki o dinku nọmba awọn iyipo