Câu hỏi thường gặp về PCR 1. Âm tính giả, không xuất hiện dải khuếch đại 2. Dương tính giả 3. Xuất hiện các dải khuếch đại không đặc hiệu 4. Xuất hiện dải kéo dễ bong hoặc dải nhòe:
1Âm tính giả, không xuất hiện dải khuếch đại. Các khía cạnh chính của phản ứng PCR là
① chuẩn bị axit nucleic mẫu
② chất lượng sơn lót và độ đặc hiệu
③ chất lượng enzyme và
④ Điều kiện chu trình PCR. Để tìm ra nguyên nhân, việc phân tích và nghiên cứu cũng cần được tiến hành trên các liên kết trên.
Bản mẫu:
① Mẫu chứa protein tạp chất
② Mẫu chứa chất ức chế enzyme Taq
③ Protein trong khuôn không bị tiêu hóa và loại bỏ, đặc biệt là histone trong nhiễm sắc thể
④ Thất thoát quá nhiều trong quá trình chiết và chuẩn bị mẫu hoặc hít phải phenol
⑤Axit nucleic mẫu không bị biến tính hoàn toàn. Khi chất lượng enzyme và mồi tốt, nếu không xuất hiện dải khuếch đại thì rất có thể có vấn đề gì đó trong quá trình tiêu hóa mẫu vật hoặc quá trình chiết axit nucleic mẫu. Vì vậy, phải chuẩn bị sẵn giải pháp tiêu hóa hiệu quả và ổn định, quy trình phải cố định và không được tùy ý thay đổi. . Bất hoạt enzyme: Cần thay thế enzyme mới hoặc sử dụng đồng thời cả enzyme cũ và mới để phân tích xem kết quả âm tính giả có phải do mất hoặc hoạt động của enzyme không đủ. Cần lưu ý rằng đôi khi enzyme Taq bị lãng quên. Mồi: Chất lượng mồi, nồng độ mồi và liệu nồng độ của hai mồi có đối xứng hay không là những nguyên nhân phổ biến dẫn đến thất bại PCR hoặc dải khuếch đại không đạt yêu cầu và dễ khuếch tán. Có vấn đề về chất lượng tổng hợp mồi ở một số lô. Một trong hai mồi có nồng độ cao và mồi còn lại có nồng độ thấp, dẫn đến khuếch đại bất đối xứng hiệu quả thấp.
Các biện pháp đối phó là:
① Chọn đơn vị tổng hợp mồi tốt.
② Nồng độ mồi không chỉ nhìn vào giá trị OD mà còn chú ý đến dung dịch gốc mồi để điện di trên gel agarose. Phải có các dải mồi và độ sáng của hai dải mồi phải gần như nhau. Ví dụ, một lớp sơn lót có dải và lớp sơn lót còn lại không có dải. Đối với các dải, PCR có thể thất bại tại thời điểm này và cần được giải quyết thông qua đàm phán với đơn vị tổng hợp mồi. Nếu một lớp sơn lót có độ sáng cao và một lớp sơn lót có độ sáng thấp thì phải cân bằng nồng độ khi pha loãng lớp sơn lót.
③ Sơn lót nên được bảo quản ở nồng độ cao và số lượng nhỏ để tránh đóng băng và rã đông nhiều lần hoặc bảo quản lâu dài trong tủ lạnh, có thể dẫn đến hư hỏng và xuống cấp của sơn lót.
④Thiết kế mồi không hợp lý, chẳng hạn như chiều dài mồi không đủ, hình thành các dimer giữa các mồi, v.v. Nồng độ Mg2+: Nồng độ ion Mg2+ có ảnh hưởng lớn đến hiệu quả khuếch đại PCR. Nếu nồng độ quá cao có thể làm giảm độ đặc hiệu của khuếch đại PCR. Nếu nồng độ quá thấp sẽ ảnh hưởng đến hiệu suất khuếch đại PCR, thậm chí khiến quá trình khuếch đại PCR không thành công nếu không có dải khuếch đại. Thay đổi thể tích phản ứng: Thông thường thể tích được sử dụng để khuếch đại PCR là 20ul, 30ul và 50ul. Hoặc 100ul, thể tích sử dụng để khuếch đại PCR được thiết lập tùy theo các mục đích nghiên cứu khoa học và thử nghiệm lâm sàng khác nhau. Sau khi tạo một khối lượng nhỏ, chẳng hạn như 20ul, rồi tạo một khối lượng lớn hơn, bạn phải tuân theo các điều kiện, nếu không sẽ dễ bị lỗi. Lý do vật lý: Sự biến tính là rất quan trọng đối với khuếch đại PCR. Nếu nhiệt độ biến tính thấp và thời gian biến tính ngắn thì rất có thể xảy ra kết quả âm tính giả; nhiệt độ ủ quá thấp, có thể gây ra sự khuếch đại không đặc hiệu và làm giảm hiệu suất khuếch đại cụ thể. Nhiệt độ ủ quá cao. Ảnh hưởng lớn đến sự liên kết của mồi với mẫu và làm giảm hiệu quả khuếch đại PCR. Đôi khi cần sử dụng nhiệt kế tiêu chuẩn để kiểm tra nhiệt độ biến tính, ủ và giãn nở trong bộ khuếch đại hoặc nồi hòa tan trong nước. Đây cũng là một trong những nguyên nhân khiến PCR thất bại. Biến đổi trình tự đích: Nếu trình tự đích bị đột biến hoặc bị xóa, điều này ảnh hưởng đến liên kết cụ thể của mồi với mẫu hoặc mồi và mẫu mất trình tự bổ sung do xóa một đoạn nhất định của trình tự đích, thì quá trình khuếch đại PCR sẽ không thành công.
2.dương tính giả Dải khuếch đại PCR xuất hiện phù hợp với dải trình tự mục tiêu và đôi khi dải khuếch đại có trật tự và sáng hơn. Thiết kế mồi không phù hợp: Trình tự khuếch đại được chọn có tính tương đồng với trình tự khuếch đại không phải mục tiêu nên khi thực hiện khuếch đại PCR, sản phẩm PCR khuếch đại là trình tự không phải mục tiêu. Nếu trình tự mục tiêu quá ngắn hoặc đoạn mồi quá ngắn thì có thể dễ dàng xảy ra kết quả dương tính giả. Sơn lót cần phải được thiết kế lại. Lây nhiễm chéo các trình tự mục tiêu hoặc các sản phẩm khuếch đại: Có hai lý do dẫn đến sự lây nhiễm này: Thứ nhất, lây nhiễm chéo toàn bộ bộ gen hoặc các đoạn lớn, dẫn đến kết quả dương tính giả. Việc dương tính giả này có thể được giải quyết bằng các phương pháp sau: Cẩn thận và nhẹ nhàng khi thao tác để chuỗi mục tiêu không bị hút vào súng lấy mẫu hoặc văng ra khỏi ống ly tâm. Ngoại trừ enzyme và các chất không chịu được nhiệt độ cao, tất cả thuốc thử hoặc thiết bị đều phải được khử trùng bằng áp suất cao. Tất cả các ống ly tâm và đầu pipet tiêm mẫu nên được sử dụng một lần. Nếu cần thiết, các ống phản ứng và thuốc thử được chiếu bằng tia cực tím trước khi thêm mẫu thử để tiêu diệt axit nucleic có trong mẫu. Thứ hai là sự ô nhiễm của các mảnh axit nucleic nhỏ trong không khí. Những đoạn nhỏ này ngắn hơn trình tự đích nhưng có tính tương đồng nhất định. Chúng có thể được ghép với nhau và sau khi bổ sung với mồi, các sản phẩm PCR có thể được khuếch đại, dẫn đến kết quả dương tính giả, có thể giảm hoặc loại bỏ bằng phương pháp PCR lồng nhau.
3. Xuất hiện các dải khuếch đại không đặc hiệu Các dải xuất hiện sau khi khuếch đại PCR không phù hợp với kích thước dự kiến, lớn hơn hoặc nhỏ hơn hoặc cả hai dải khuếch đại cụ thể và dải khuếch đại không đặc hiệu đều xuất hiện cùng một lúc. Nguyên nhân dẫn đến sự xuất hiện của các dải không đặc hiệu là: thứ nhất, các đoạn mồi không bổ sung hoàn toàn cho trình tự mục tiêu hoặc các đoạn mồi tổng hợp lại để tạo thành các dimer. Nguyên nhân thứ hai là nồng độ ion Mg2+ quá cao, nhiệt độ ủ quá thấp và số chu kỳ PCR quá cao. Yếu tố thứ hai là chất lượng và số lượng enzyme. Enzyme từ một số nguồn thường có xu hướng tạo ra các dải không đặc hiệu nhưng enzyme từ các nguồn khác thì không. Lượng enzyme quá mức đôi khi có thể dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu. Các biện pháp đối phó bao gồm: thiết kế lại mồi nếu cần thiết. Giảm lượng enzyme hoặc thay thế bằng nguồn khác. Giảm lượng mồi, tăng lượng mẫu phù hợp và giảm số chu kỳ. Tăng nhiệt độ ủ thích hợp hoặc sử dụng phương pháp hai điểm nhiệt độ (biến tính ở 93°C, ủ và giãn ở khoảng 65°C).
4. Xuất hiện các vệt kéo hoặc vết mờ. Khuếch đại PCR đôi khi xuất hiện dưới dạng các dải bị nhòe, các dải giống như tấm hoặc các dải giống như tấm thảm. Nguyên nhân thường do lượng enzyme quá nhiều hoặc chất lượng enzyme kém, nồng độ dNTP quá cao, nồng độ Mg2+ quá cao, nhiệt độ ủ quá thấp và quá nhiều chu kỳ. Các biện pháp đối phó bao gồm: ① Giảm lượng enzyme hoặc thay thế enzyme bằng nguồn khác. ②Giảm nồng độ dNTP. Giảm nồng độ Mg2+ một cách thích hợp. Tăng số lượng mẫu và giảm số chu kỳ
