PCR tez-tez so'raladigan savollar 1. Noto'g'ri manfiy, kuchaytirish diapazoni ko'rinmaydi 2. Noto'g'ri musbat 3. Nomaxsus kuchaytirish diapazonlari paydo bo'ladi 4. Yaltiroq tortish chiziqlari yoki smear chiziqlari paydo bo'ladi:

1Noto'g'ri salbiy, kuchaytirilgan chiziq ko'rinmaydi PCR reaktsiyasining asosiy jihatlari

① shablon nuklein kislotasini tayyorlash

② primer sifati va o'ziga xosligi

③ ferment sifati va

④ PCR tsiklining shartlari. Sabablarini topish uchun yuqoridagi havolalar bo'yicha tahlil va tadqiqotlar ham o'tkazilishi kerak.

Andoza:

① Shablonda nopok oqsillar mavjud

② Shablonda Taq fermenti ingibitorlari mavjud

③ Shablondagi oqsillar hazm qilinmaydi va olib tashlanmaydi, ayniqsa xromosomalardagi gistonlar.

④ Shablonni olish va tayyorlash paytida juda ko'p narsa yo'qolgan yoki fenol nafas olingan

⑤ Shablon nuklein kislotasi to'liq denatüratsiyalanmagan. Fermentlar va primerlarning sifati yaxshi bo'lsa, kuchaytiruvchi chiziqlar paydo bo'lmasa, namunaning hazm qilish jarayonida yoki shablonning nuklein kislotasini olish jarayonida biror narsa noto'g'ri bo'lishi mumkin. Shuning uchun, samarali va barqaror hazm qilish eritmasi tayyorlanishi kerak va protsedurani tuzatish kerak va o'z xohishiga ko'ra o'zgartirilmasligi kerak. . Fermentning inaktivatsiyasi: yangi fermentni almashtirish yoki bir vaqtning o'zida eski va yangi fermentlarni ishlatish, noto'g'ri negativlar fermentning yo'qolishi yoki etarli emasligi tufayli yuzaga kelganligini tahlil qilish uchun kerak. Shuni ta'kidlash kerakki, ba'zida Taq fermenti unutiladi. Primerlar: Primer sifati, primer konsentratsiyasi va ikkita primerning konsentratsiyasi simmetrik bo'ladimi, bu PCR etishmovchiligi yoki qoniqarsiz kuchaytiruvchi bantlar va oson diffuziya uchun keng tarqalgan sabablardir. Ba'zi partiyalarda primer sintezining sifati bilan bog'liq muammolar mavjud. Ikki primerdan biri yuqori konsentratsiyaga ega, ikkinchisi esa past konsentratsiyaga ega, natijada past samaradorlik assimetrik kuchaytiriladi.

Qarshi choralar quyidagilardir:

① Yaxshi primer sintez qurilmasini tanlang.

② Primerlarning kontsentratsiyasi nafaqat OD qiymatiga, balki agaroz gel elektroforezi uchun primer zaxira eritmasiga ham e'tibor berish kerak. Primer bantlar bo'lishi kerak va ikkita primer bantning yorqinligi taxminan bir xil bo'lishi kerak. Misol uchun, bir primerda tarmoqli bor, ikkinchisi esa tarmoqli yo'q. Chiziqlar uchun PCR hozirda muvaffaqiyatsiz bo'lishi mumkin va uni primer sintez birligi bilan muzokaralar orqali hal qilish kerak. Agar bir primer yuqori yorqinlikka ega bo'lsa, ikkinchisi past yorqinlikka ega bo'lsa, primerlarni suyultirishda konsentratsiyalarni muvozanatlashtiring.

③ Astarlarni qayta-qayta muzlash va eritish yoki muzlatgichda uzoq muddat saqlashning oldini olish uchun yuqori konsentratsiyada va oz miqdorda saqlanishi kerak, bu esa astarlarning buzilishi va degradatsiyasiga olib kelishi mumkin.

④Primer dizayni asossiz, masalan, primer uzunligi yetarli emas, primerlar orasida dimerlar hosil boʻladi va hokazo. Mg2+ konsentratsiyasi: Mg2+ ion kontsentratsiyasi PCR kuchaytirish samaradorligiga katta taʼsir koʻrsatadi. Agar konsentratsiya juda yuqori bo'lsa, u PCR kuchaytirilishining o'ziga xosligini kamaytirishi mumkin. Agar kontsentratsiya juda past bo'lsa, bu PCR kuchaytirilishining rentabelligiga ta'sir qiladi va hatto bantlarni kuchaytirmasdan PCR kuchaytirilishining ishlamay qolishiga olib keladi. Reaktsiya hajmining o'zgarishi: Odatda PCR kuchaytirilishi uchun ishlatiladigan hajmlar 20ul, 30ul va 50ul. Yoki 100ul, PCRni kuchaytirish uchun qanday hajmdan foydalanish kerakligi ilmiy tadqiqotlar va klinik sinovlarning turli maqsadlariga muvofiq belgilanadi. Kichik hajmni, masalan, 20ul qilib, keyin kattaroq hajmni yaratgandan so'ng, siz shartlarga rioya qilishingiz kerak, aks holda u osonlikcha muvaffaqiyatsiz bo'ladi. Jismoniy sabablar: denaturatsiya PCR kuchaytirilishi uchun juda muhimdir. Agar denaturatsiya harorati past bo'lsa va denatürasyon vaqti qisqa bo'lsa, noto'g'ri salbiy holatlar yuzaga kelishi ehtimoli juda katta; tavlanish harorati juda past, bu o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirishga olib kelishi va o'ziga xos kuchaytirish samaradorligini kamaytirishi mumkin. Yuvish harorati juda yuqori. Primerlarning shablonlarga bog'lanishiga yuqori darajada ta'sir qiladi va PCR kuchaytirish samaradorligini pasaytiradi. Ba'zan kuchaytirgich yoki suvda eruvchan qozondagi denatürasyon, tavlanish va cho'zish haroratini tekshirish uchun standart termometrdan foydalanish kerak. Bu ham PCR muvaffaqiyatsizligining sabablaridan biridir. Maqsadli ketma-ketlikning o'zgarishi: agar maqsadli ketma-ketlik mutatsiyaga uchragan yoki o'chirilgan bo'lsa, bu primerning shablonga o'ziga xos bog'lanishiga ta'sir qilsa yoki primer va shablon maqsadli ketma-ketlikning ma'lum bir segmentini o'chirish tufayli to'ldiruvchi ketma-ketlikni yo'qotsa, PCR kuchaytirilishi. muvaffaqiyatli bo'lmaydi.

2.false musbat Ko'rinadigan PCR kuchaytiruvchi diapazoni maqsadli ketma-ketlik bandiga mos keladi, ba'zan esa tarmoq yanada tartibli va yorqinroq bo'ladi. Noto'g'ri primer dizayni: tanlangan kuchaytirish ketma-ketligi maqsadli bo'lmagan kuchaytirish ketma-ketligi bilan homologiyaga ega, shuning uchun PCR kuchaytirilishini amalga oshirayotganda, kuchaytirilgan PCR mahsuloti maqsadli bo'lmagan ketma-ketlikdir. Agar maqsadli ketma-ketlik juda qisqa bo'lsa yoki primer juda qisqa bo'lsa, noto'g'ri ijobiy natijalar osongina paydo bo'lishi mumkin. Primerlarni qayta ishlab chiqish kerak. Maqsadli ketma-ketliklar yoki kuchaytirish mahsulotlarining o'zaro kontaminatsiyasi: Bu ifloslanishning ikkita sababi bor: Birinchidan, butun genomning yoki katta bo'laklarning o'zaro kontaminatsiyasi, noto'g'ri musbatlarga olib keladi. Ushbu noto'g'ri musbatni quyidagi usullar bilan hal qilish mumkin: Nishon ketma-ketligi namuna tabancasiga so'rilib ketmasligi yoki santrifüj trubkasidan sachramasligi uchun ishlayotganda ehtiyot bo'ling va muloyim bo'ling. Yuqori haroratga bardosh bera olmaydigan fermentlar va moddalardan tashqari, barcha reagentlar yoki jihozlar yuqori bosim bilan sterilizatsiya qilinishi kerak. Barcha santrifüj naychalari va namunali in'ektsiya pipetkalari uchlari bir marta ishlatilishi kerak. Agar kerak bo'lsa, reaktsiya naychalari va reagentlar mavjud nuklein kislotalarni yo'q qilish uchun namunani qo'shishdan oldin ultrabinafsha nurlar bilan nurlanadi. Ikkinchisi - havodagi nuklein kislotalarning kichik bo'laklarining ifloslanishi. Ushbu kichik qismlar maqsadli ketma-ketlikdan qisqaroq, ammo ma'lum bir homologiyaga ega. Ular bir-biriga bog'langan bo'lishi mumkin va primerlarga qo'shimcha bo'lgandan so'ng, PCR mahsulotlari kuchaytirilishi mumkin, buning natijasida noto'g'ri pozitivlar paydo bo'ladi, ularni ichki PCR usullari bilan kamaytirish yoki yo'q qilish mumkin.

 

3.Spesifik bo'lmagan kuchaytirish diapazonlari paydo bo'ladi PCR kuchaytirilgandan so'ng paydo bo'ladigan chiziqlar kutilgan o'lchamga mos kelmaydi, kattaroq yoki kichikroq yoki har ikkala o'ziga xos kuchaytirish va o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirish bantlari bir vaqtning o'zida paydo bo'ladi. O'ziga xos bo'lmagan bantlar paydo bo'lishining sabablari: birinchidan, primerlar maqsadli ketma-ketlikni to'liq to'ldirmaydi yoki primerlar dimerlarni hosil qilish uchun birlashadi. Ikkinchi sabab, Mg2+ ion kontsentratsiyasi juda yuqori, tavlanish harorati juda past va PCR davrlari soni juda yuqori. Ikkinchi omil - fermentning sifati va miqdori. Ba'zi manbalardan olingan fermentlar ko'pincha o'ziga xos bo'lmagan chiziqlarga moyil bo'ladi, ammo boshqa manbalardan olingan fermentlar yo'q. Haddan tashqari miqdorda fermentlar ba'zan o'ziga xos bo'lmagan kuchaytirilishiga olib kelishi mumkin. Qarshi choralar quyidagilarni o'z ichiga oladi: agar kerak bo'lsa, astarlarni qayta loyihalash. Ferment miqdorini kamaytiring yoki uni boshqa manba bilan almashtiring. Primerlar miqdorini kamaytiring, shablon miqdorini mos ravishda oshiring va tsikllar sonini kamaytiring. Yuvish haroratini mos ravishda oshiring yoki ikki haroratli nuqta usulini qo'llang (93 ° C da denatürasyon, 65 ° C atrofida yumshatish va uzaytirish).

 

4.Yopqoq drag yoki smear paydo bo'ladi PCR kuchaytirilishi ba'zan bulg'angan bantlar, choyshabga o'xshash tasmalar yoki gilamga o'xshash tasmalar ko'rinishida paydo bo'ladi. Sabablari ko'pincha juda ko'p ferment yoki fermentning past sifati, juda yuqori dNTP kontsentratsiyasi, juda yuqori Mg2 + kontsentratsiyasi, juda past tavlanish harorati va juda ko'p tsikllardan kelib chiqadi. Qarshi choralar quyidagilardan iborat: ① Ferment miqdorini kamaytirish yoki fermentni boshqa manba bilan almashtirish. ②dNTP kontsentratsiyasini kamaytiring. Mg2+ konsentratsiyasini mos ravishda kamaytiring. Shablonlar miqdorini oshiring va tsikllar sonini kamaytiring