بائیو کیمسٹری ریسرچ اور ایپلی کیشن میں پروٹین کی علیحدگی اور صاف کرنا بڑے پیمانے پر استعمال ہوتا ہے اور یہ ایک اہم آپریشنل ہنر ہے۔ ایک عام یوکرائیوٹک سیل میں ہزاروں مختلف پروٹین ہوتے ہیں، کچھ بہت امیر ہوتے ہیں اور کچھ میں صرف چند کاپیاں ہوتی ہیں۔ ایک خاص مطالعہ کرنے کے لئےپروٹینسب سے پہلے پروٹین کو دوسرے پروٹین اور غیر پروٹین مالیکیولز سے پاک کرنا ضروری ہے۔

1. نمکین نکالنے کا طریقہپروٹین:

غیر جانبدار نمک پروٹین کی گھلنشیلتا پر ایک اہم اثر ہے. عام طور پر، نمک کی کم ارتکاز کے تحت نمک کی مقدار میں اضافے کے ساتھ، پروٹین کی گھلنشیلتا بڑھ جاتی ہے۔ اسے سالٹنگ کہتے ہیں۔ جب نمک کا ارتکاز بڑھتا رہتا ہے، تو پروٹین کی حل پذیری مختلف ڈگریوں تک کم ہو جاتی ہے اور ایک کے بعد ایک الگ ہو جاتی ہے۔ اس رجحان کو سالٹنگ آؤٹ کہا جاتا ہے۔

2. آئیسو الیکٹرک پوائنٹ اسٹیکنگ کا طریقہ:

جب پروٹین جامد ہو تو ذرات کے درمیان الیکٹرو اسٹیٹک ریپلشن سب سے چھوٹا ہوتا ہے، اس لیے حل پذیری بھی سب سے چھوٹی ہوتی ہے۔ مختلف پروٹینوں کے آئسو الیکٹرک پوائنٹس مختلف ہوتے ہیں۔ کنڈیشنگ سلوشن کا پی ایچ کسی پروٹین کے آئسو الیکٹرک پوائنٹ تک پہنچنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے، اسے جمع کریں، لیکن یہ طریقہ شاذ و نادر ہی اکیلے استعمال ہوتا ہے اور اسے نمکین آؤٹ طریقہ کے ساتھ ملایا جا سکتا ہے۔

3. ڈائیلاسز اور الٹرا فلٹریشن:

ڈائلیسس مختلف مالیکیولر سائز کے پروٹین کو الگ کرنے کے لیے نیم پارگمی جھلی کا استعمال کرتا ہے۔ الٹرا فلٹریشن کا طریقہ پانی اور دیگر چھوٹے محلول مالیکیولز کو نیم پارگمی جھلی سے گزرنے کے لیے ہائی پریشر یا سینٹرفیوگل فورس کا استعمال کرتا ہے، جبکہپروٹینجھلی پر رہتا ہے. آپ مختلف مالیکیولر وزن کے پروٹین کو روکنے کے لیے مختلف تاکنا سائز منتخب کر سکتے ہیں۔

4. جیل فلٹریشن کا طریقہ:

سائز اخراج کرومیٹوگرافی یا سالماتی چھلنی کرومیٹوگرافی بھی کہا جاتا ہے، یہ سالماتی سائز کے مطابق پروٹین کے مرکب کو الگ کرنے کے لیے سب سے مفید طریقوں میں سے ایک ہے۔ کالم میں عام طور پر استعمال ہونے والا پیکنگ مواد گلوکوز جیل (Sephadex ged) اور agarose جیل (agarose gel) ہیں۔

الیکٹروفورسس:

اسی پی ایچ کی حالت کے تحت، مختلف پروٹینوں کو ان کے مختلف مالیکیولر وزن اور برقی میدان میں مختلف چارجز کی وجہ سے الگ کیا جا سکتا ہے۔ یہ آئسو الیکٹرک سیٹ الیکٹروفورسس پر توجہ دینے کے قابل ہے، جو ایمفولائٹ کو کیریئر کے طور پر استعمال کرتا ہے۔ الیکٹروفورسس کے دوران، ایمفولائٹ ایک پی ایچ میلان بناتا ہے جو مثبت الیکٹروڈ سے منفی الیکٹروڈ میں آہستہ آہستہ شامل ہوتا ہے۔ جب ایک خاص چارج والا پروٹین اس میں تیرتا ہے تو یہ ایک دوسرے تک پہنچ جاتا ہے۔ برقی نقطہ کی پی ایچ کی پوزیشن متضاد ہے، اور یہ طریقہ مختلف پروٹینوں کا تجزیہ اور تیاری کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔

6. آئن کمیونیکیشن کرومیٹوگرافی:

آئن کمیونیکیشن ایجنٹس میں cationic کمیونیکیشن ایجنٹ (جیسے carboxymethyl cellulose؛ CM-cellulose) اور anionic کمیونیکیشن ایجنٹس (diethylaminoethyl cellulose) شامل ہیں۔ آئن کمیونیکیشن کرومیٹوگرافی کالم سے گزرتے وقت، آئن کمیونیکیشن ایجنٹ کے مخالف چارج والا پروٹین آئن کمیونیکیشن ایجنٹ پر جذب ہوتا ہے، اور پھر جذب ہوتا ہے۔پروٹینpH یا ionic طاقت کو تبدیل کرکے eluted کیا جاتا ہے۔

7. تعلق کی کرومیٹوگرافی:

پروٹین کو الگ کرنے کے لیے افینیٹی کرومیٹوگرافی ایک انتہائی مفید طریقہ ہے۔ اعلی طہارت کے ساتھ گندے پروٹین کے مرکب سے پاک ہونے کے لیے کسی خاص پروٹین کو الگ کرنے کے لیے اکثر صرف ایک قدم کی ضرورت ہوتی ہے۔

یہ طریقہ مخصوص پروٹینوں کے کسی دوسرے مالیکیول کے ساتھ ہم آہنگی کے بجائے مخصوص پر مبنی ہے جسے ligand (Ligand) کہتے ہیں۔

بنیادی اصول:

پروٹین ٹشوز یا خلیوں میں گندے مرکب میں موجود ہیں، اور ہر قسم کے سیل میں ہزاروں مختلف پروٹین ہوتے ہیں۔ لہذا، پروٹین کے درمیان فرق حیاتیاتی کیمیا کا ایک اہم حصہ ہے، اور یہ اکیلے نہیں ہے. یا تیار شدہ طریقوں کا ایک سیٹ گندے ہوئے مخلوط پروٹین سے کسی بھی قسم کے پروٹین کو ہٹا سکتا ہے، لہذا کئی طریقے اکثر مجموعہ میں استعمال ہوتے ہیں۔