Поширені запитання щодо ПЛР 1. Хибнонегативний результат, відсутність смуги ампліфікації 2. Хибнопозитивний результат 3. З’являються неспецифічні смуги ампліфікації 4. З’являються смужки, що луснуть, або мазки:

1 Хибнонегативний результат, посилена смуга не з’являється Ключовими аспектами реакції ПЛР є

① приготування матричної нуклеїнової кислоти

② праймер якість і специфічність

③ якість ферменту і

④ Умови циклу ПЛР. Щоб знайти причини, також слід провести аналіз і дослідження за наведеними вище посиланнями.

Шаблон:

① Шаблон містить білки-домішки

② Шаблон містить інгібітори ферменту Taq

③ Білки в матриці не перетравлюються та не видаляються, особливо гістони в хромосомах

④ Надто багато було втрачено під час вилучення та підготовки шаблону, або фенол вдихнувся

⑤Матрична нуклеїнова кислота не повністю денатурована. Якщо якість ферментів і праймерів хороша, якщо смуги ампліфікації не з’являються, найімовірніше, щось не так із процесом перетравлення зразка або процесом екстракції нуклеїнової кислоти матриці. Тому необхідно підготувати ефективний і стабільний розчин для травлення, а процедуру слід зафіксувати й не змінювати за бажанням. . Інактивація ферменту: необхідно замінити новий фермент або використовувати старий і новий ферменти одночасно, щоб проаналізувати, чи помилково негативні результати викликані втратою або недостатньою активністю ферменту. Слід зазначити, що інколи про фермент Taq забувають. Праймери: якість праймерів, концентрація праймерів і те, чи є концентрації двох праймерів симетричними, є поширеними причинами невдачі ПЛР або незадовільних смуг ампліфікації та легкої дифузії. У деяких партіях є проблеми з якістю синтезу праймера. Один з двох праймерів має високу концентрацію, а інший має низьку концентрацію, що призводить до низькоефективної асиметричної ампліфікації.

Контрзаходи такі:

① Виберіть хороший блок синтезу праймера.

② Концентрацію праймерів слід дивитися не лише на значення OD, але також звертати увагу на основний розчин праймерів для електрофорезу в агарозному гелі. Повинні бути смуги грунтовки, і яскравість двох смужок грунтовки має бути приблизно однаковою. Наприклад, один праймер має стрічку, а інший праймер не має смуги. Для смужок ПЛР у цей час може бути невдалою, і це слід вирішити шляхом узгодження з блоком синтезу праймерів. Якщо один праймер має високу яскравість, а інший має низьку яскравість, збалансуйте концентрації під час розведення праймерів.

③ Праймери слід зберігати у високій концентрації та невеликих кількостях, щоб запобігти повторному заморожуванню та розморожуванню або тривалому зберіганню в холодильнику, що може призвести до псування та деградації праймерів.

④Конструкція праймера необґрунтована, наприклад, довжина праймера недостатня, між праймерами утворюються димери тощо. Концентрація Mg2+: концентрація іонів Mg2+ має великий вплив на ефективність ампліфікації ПЛР. Якщо концентрація занадто висока, це може знизити специфічність ПЛР-ампліфікації. Якщо концентрація надто низька, це вплине на продуктивність ПЛР-ампліфікації та навіть спричинить невдачу ПЛР-ампліфікації без ампліфікаційних смуг. Зміни в реакційному об’ємі: зазвичай для ПЛР-ампліфікації використовуються об’єми 20, 30 і 50 мкл. Або 100 мкл, який об’єм слід використовувати для ПЛР-ампліфікації, встановлюється відповідно до різних цілей наукових досліджень і клінічних випробувань. Зробивши невеликий об’єм, наприклад 20 мкл, а потім зробивши більший об’єм, ви повинні дотримуватися умов, інакше він легко вийде з ладу. Фізичні причини: денатурація дуже важлива для ПЛР-ампліфікації. Якщо температура денатурації низька, а час денатурації короткий, велика ймовірність помилкових негативних результатів; температура відпалу занадто низька, що може спричинити неспецифічне посилення та знизити ефективність специфічного посилення. Температура відпалу занадто висока. Сильно впливає на зв'язування праймерів з матрицями та знижує ефективність ПЛР-ампліфікації. Іноді необхідно використовувати стандартний термометр для перевірки температур денатурації, відпалу та розширення в підсилювачі або водорозчинній ємності. Це теж одна з причин невдачі ПЛР. Варіація цільової послідовності: якщо цільова послідовність мутована або видалена, що впливає на специфічне зв’язування праймера з матрицею, або праймер і матриця втрачають комплементарну послідовність через делецію певного сегмента цільової послідовності, ПЛР-ампліфікація не буде успішним.

2. хибнопозитивний. Смуга ампліфікації ПЛР, яка з’являється, відповідає смузі цільової послідовності, іноді смуга більш упорядкована та яскравіша. Невідповідний дизайн праймера: обрана послідовність ампліфікації має гомологію з нецільовою послідовністю ампліфікації, тому під час виконання ПЛР-ампліфікації ампліфікований продукт ПЛР є нецільовою послідовністю. Якщо цільова послідовність занадто коротка або праймер занадто короткий, можуть легко виникнути помилкові позитивні результати. Праймери потрібно переробити. Перехресне зараження цільових послідовностей або продуктів ампліфікації. Є дві причини цього зараження: по-перше, перехресне зараження всього геному або великих фрагментів, що призводить до хибних позитивних результатів. Цей хибний позитивний результат можна вирішити за допомогою таких методів: Будьте обережні та обережні під час роботи, щоб запобігти засмоктуванню цільової послідовності в пістолет для зразків або бризку з центрифужної пробірки. За винятком ферментів і речовин, які не витримують високих температур, усі реагенти або обладнання слід стерилізувати під високим тиском. Усі центрифужні пробірки та наконечники піпеток для введення зразків слід використовувати один раз. Якщо необхідно, реакційні пробірки та реагенти опромінюють ультрафіолетовим світлом перед додаванням зразка для руйнування присутніх нуклеїнових кислот. Другий – забруднення повітря дрібними фрагментами нуклеїнових кислот. Ці маленькі фрагменти коротші за цільову послідовність, але мають певну гомологію. Вони можуть бути зрощені один з одним, і після того, як вони доповнюють праймери, продукти ПЛР можуть бути ампліфіковані, що призводить до хибних позитивних результатів, які можна зменшити або усунути за допомогою методів вкладеної ПЛР.

 

3. З’являються смуги неспецифічної ампліфікації. Смуги, які з’являються після ПЛР-ампліфікації, не відповідають очікуваному розміру, або більші, або менші, або одночасно з’являються як специфічні, так і неспецифічні смуги ампліфікації. Причинами появи неспецифічних смуг є: по-перше, праймери не повністю комплементарні цільовій послідовності, або праймери агрегують, утворюючи димери. Друга причина полягає в тому, що концентрація іонів Mg2+ занадто висока, температура відпалу занадто низька, а кількість циклів ПЛР занадто велика. Другим фактором є якість і кількість ферменту. Ферменти з деяких джерел часто схильні до неспецифічних смуг, а ферменти з інших джерел – ні. Надмірна кількість ферментів іноді може призвести до неспецифічної ампліфікації. Контрзаходи включають: переробку праймерів, якщо необхідно. Зменшіть кількість ферменту або замініть його іншим джерелом. Зменшіть кількість праймерів, відповідно збільште кількість шаблону та зменшіть кількість циклів. Відповідним чином підвищте температуру відпалу або використовуйте метод двох температурних точок (денатурація при 93 °C, відпал і розширення приблизно при 65 °C).

 

4. З’являються лусочки або мазки. ПЛР-ампліфікація іноді виглядає як змазані смуги, листові або килимові смуги. Причини часто викликані занадто великою кількістю ферменту або низькою якістю ферменту, занадто високою концентрацією dNTP, занадто високою концентрацією Mg2+, занадто низькою температурою відпалу та занадто великою кількістю циклів. Контрзаходи включають: ① Зменшіть кількість ферменту або замініть фермент іншим джерелом. ②Зменшити концентрацію dNTP. Відповідним чином зменшити концентрацію Mg2+. Збільште кількість шаблонів і зменшіть кількість циклів