PCR سوئاللىرى 1.

1 خاتا مەنپىي ، كۈچەيتىلگەن بەلۋاغ كۆرۈنمەيدۇ PCR ئىنكاسىنىڭ مۇھىم تەرەپلىرى

قېلىپلىق يادرو كىسلاتاسىنى تەييارلاش

Primer primer quality and specificity

③ ئېنزىم سۈپىتى ۋە

R PCR دەۋرىيلىك شارائىتى. سەۋەبىنى تېپىش ئۈچۈن ، يۇقىرىدىكى ئۇلىنىشلاردىمۇ تەھلىل ۋە تەتقىقات ئېلىپ بېرىش كېرەك.

قېلىپ:

① قېلىپتا نىجاسەت ئاقسىل بار

Template قېلىپتا تاق ئېنزىم چەكلىگۈچ بار

The قېلىپتىكى ئاقسىللار ھەزىم قىلىنمايدۇ ۋە چىقىرىۋېتىلمەيدۇ ، بولۇپمۇ خىروموسومدىكى گىستون

The قېلىپنى ئېلىش ۋە تەييارلاش جەريانىدا بەك كۆپ يوقاپ كەتتى ، ياكى فېنول سۈمۈرۈلدى

Template ئەندىزە يادرو كىسلاتاسى پۈتۈنلەي ئايرىلمايدۇ. فېرمېنت ۋە پىرىمېرلارنىڭ سۈپىتى ياخشى بولغاندا ، ئەگەر كۈچەيتمە بەلۋاغ كۆرۈنمىسە ، ئەۋرىشكىنىڭ ھەزىم قىلىش جەريانى ياكى قېلىپ يادرو كىسلاتاسىنى ئېلىش جەريانىدا خاتالىق بولۇشى مۇمكىن. شۇڭلاشقا ، ئۈنۈملۈك ۋە مۇقىم ھەزىم قىلىش چارىسى تەييارلىنىشى ، تەرتىپنى مۇقىملاشتۇرۇپ ، خالىغانچە ئۆزگەرتمەسلىك كېرەك. . فېرمېنتنىڭ ئاكتىپسىزلىنىشى: يېڭى ئېنزىمنى ئالماشتۇرۇش ، ياكى كونا ۋە يېڭى فېرمېنتلارنى بىرلا ۋاقىتتا ئىشلىتىپ ، يالغان پاسسىپلىقنىڭ يوقىتىش ياكى فېرمېنتنىڭ يېتەرلىك بولماسلىقىدىن كېلىپ چىققان ياكى ئەمەسلىكىنى تەھلىل قىلىش كېرەك. دىققەت قىلىشقا تېگىشلىكى شۇكى ، بەزىدە تاق فېرمېنتى ئۇنتۇلۇپ كېتىدۇ. باھا بەرگۈچىلەر: دەسلەپكى سۈپەت ، دەسلەپكى قويۇقلۇق دەرىجىسى ۋە ئىككى خىل پىرىماتنىڭ قويۇقلۇقى سىممېترىك ياكى ئەمەسلىكى PCR مەغلۇبىيىتى ياكى قانائەتلىنەرلىك كۈچەيتمە بەلۋاغ ۋە ئاسان تارقىلىشنىڭ ئورتاق سەۋەبى. بەزى گۇرۇپپىلاردا دەسلەپكى قەدەمدە بىرىكتۈرۈش سۈپىتىدە مەسىلە بار. بۇ ئىككى پىرىمېرنىڭ بىرىنىڭ قويۇقلۇقى يۇقىرى ، يەنە بىرىنىڭ قويۇقلۇقى تۆۋەن ، نەتىجىدە تۆۋەن ئۈنۈملۈك سىممېترىك كۈچەيمەيدۇ.

قارشى تەدبىرلەر:

Prim ياخشى بولغان دەسلەپكى بىرىكمە بۆلەكنى تاللاڭ.

Prim پىرىمېرلارنىڭ قويۇقلۇقى OD قىممىتىگە قاراپلا قالماي ، يەنە ئاگاروزا گېلى ئېلېكتروفورېزىنىڭ دەسلەپكى زاپاس ھەل قىلىش ئۇسۇلىغىمۇ دىققەت قىلىشى كېرەك. چوقۇم دەسلەپكى بەلۋاغ بولۇشى كېرەك ، ئىككى دەسلەپكى بەلۋاغنىڭ يورۇقلۇقى ئاساسەن ئوخشاش بولۇشى كېرەك. مەسىلەن ، بىر پىرىماتورنىڭ بەلۋاغ ، يەنە بىر قەغەزنىڭ بەلۋاغ يوق. بەلۋاغقا نىسبەتەن ، PCR بۇ ۋاقىتتا مەغلۇپ بولۇشى مۇمكىن ، دەسلەپكى بىرىكمە ئورۇن بىلەن سۆھبەتلىشىش ئارقىلىق ھەل قىلىنىشى كېرەك. ئەگەر بىر قەغەزنىڭ يورۇقلۇقى يۇقىرى بولسا ، يەنە بىرىنىڭ يورۇقلۇق دەرىجىسى تۆۋەن بولسا ، پىرىسنى سۇيۇلدۇرغاندا قويۇقلۇقىنى تەڭپۇڭلاشتۇرۇڭ.

③ پىرىمېرنى يۇقىرى قويۇقلۇقتا ۋە ئاز مىقداردا ساقلاش كېرەك ، توڭلاتقۇدا قايتا-قايتا مۇزلاش ۋە ئېرىتىش ياكى ئۇزۇن مۇددەت ساقلاشنىڭ ئالدىنى ئېلىش كېرەك ، بۇ پىرىمېرلارنىڭ ناچارلىشىشى ۋە ناچارلىشىشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىشى مۇمكىن.

Prim دەسلەپكى لايىھىلەش ئەقىلگە سىغمايدۇ ، مەسىلەن دەسلەپكى ئۇزۇنلۇقى يېتەرلىك ئەمەس ، پىرىمېرلار ئارىسىدا ۋاقىت سىزىقى شەكىللىنىدۇ. Mg2 + قويۇقلۇقى: Mg2 + ئىئون قويۇقلۇقى PCR كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە زور تەسىر كۆرسىتىدۇ. ئەگەر قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى بولسا ، PCR كۈچەيتىشنىڭ كونكرېتلىقىنى ئازايتالايدۇ. ئەگەر قويۇقلۇقى بەك تۆۋەن بولسا ، ئۇ PCR كۈچەيتىش ئۈنۈمىگە تەسىر كۆرسىتىدۇ ، ھەتتا بەلۋاغنى كۈچەيتمەي PCR كېڭەيتىشنىڭ مەغلۇپ بولۇشىنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. رېئاكسىيە مىقدارىنىڭ ئۆزگىرىشى: ئادەتتە PCR كېڭەيتىشكە ئىشلىتىلىدىغان ھەجىم 20ul ، 30ul ۋە 50ul بولىدۇ. ياكى 100ul ، PCR كېڭەيتىشتە قايسى ھەجىم ئىشلىتىش كېرەكلىكى ئوخشىمىغان ئىلمىي تەتقىقات ۋە كلىنىكىلىق سىناقلارغا ئاساسەن بېكىتىلىدۇ. 20ul غا ئوخشاش كىچىك ھەجىم ھاسىل قىلىپ ، ئاندىن تېخىمۇ چوڭ ھەجىم ھاسىل قىلغاندىن كېيىن ، چوقۇم شەرتكە ئەمەل قىلىشىڭىز كېرەك ، بولمىسا ئاسانلا مەغلۇپ بولىدۇ. فىزىكىلىق سەۋەبلەر: PCR نىڭ كۈچەيتىلىشى ئۈچۈن ئايرىش ئىنتايىن مۇھىم. ئەگەر ئايرىش تېمپېراتۇرىسى تۆۋەن بولۇپ ، ئايرىش ۋاقتى قىسقا بولسا ، يالغان پاسسىپ ئەھۋاللار كۆرۈلىشى مۇمكىن. ياندۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بەك تۆۋەن بولۇپ ، بۇ ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ ۋە كونكرېت كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى تۆۋەنلىتىدۇ. تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بەك يۇقىرى. پىرىمېرلارنىڭ قېلىپلارغا باغلىنىشىغا زور تەسىر كۆرسىتىپ ، PCR كۈچەيتىش ئۈنۈمىنى تۆۋەنلىتىدۇ. بەزىدە ئۆلچەملىك تېرمومېتىر ئىشلىتىپ كۈچەيتكۈچ ياكى سۇدا ئېرىيدىغان قازاندىكى ئايرىش ، ياندۇرۇش ۋە كېڭەيتىش تېمپېراتۇرىسىنى تەكشۈرۈشكە توغرا كېلىدۇ. بۇمۇ PCR مەغلۇب بولۇشىدىكى سەۋەبلەرنىڭ بىرى. نىشان تەرتىپىنىڭ ئۆزگىرىشى: ئەگەر نىشان تەرتىپى ئۆزگەرتىلسە ياكى ئۆچۈرۈلسە ، بۇ كۆرسەتكۈچنىڭ قېلىپ بىلەن كونكرېت باغلىنىشىغا تەسىر يەتكۈزىدىغان بولسا ، ياكى دەسلەپكى تەرتىپ ۋە قېلىپ نىشان تەرتىپنىڭ مەلۇم بىر بۆلىكىنىڭ ئۆچۈرۈلۈشى سەۋەبىدىن تولۇقلاش تەرتىپىنى يوقىتىپ قويسا ، PCR كۈچەيتىلىدۇ. مۇۋەپپەقىيەت قازىنالمايدۇ.

2. يالغان مۇسبەت پەيدا بولغان PCR كۈچەيتمە بەلۋاغ نىشان تەرتىپ بەلبېغى بىلەن بىردەك ، بەزىدە بەلۋاغ تېخىمۇ تەرتىپلىك ۋە پارقىراق بولىدۇ. نامۇۋاپىق دەسلەپكى لايىھە لايىھىسى: تاللانغان كۈچەيتمە تەرتىپنىڭ نىشانسىز كېڭەيتىش تەرتىپى بىلەن گومولوگىيەسى بار ، شۇڭا PCR كۈچەيتكەندە ، كۈچەيتىلگەن PCR مەھسۇلاتى نىشانسىز تەرتىپ. ئەگەر نىشان تەرتىپى بەك قىسقا بولسا ياكى پىرىسلاش بەك قىسقا بولسا ، يالغان ئاكتىپلار ئاسانلا يۈز بېرىشى مۇمكىن. باشلانغۇچنى قايتىدىن لايىھىلەش كېرەك. نىشان تەرتىپى ياكى كۈچەيتمە مەھسۇلاتلارنىڭ ئۆز-ئارا بۇلغىنىشى: بۇ خىل بۇلغىنىشنىڭ ئىككى سەۋەبى بار: بىرىنچىسى ، پۈتكۈل گېن ياكى چوڭ پارچىلارنى ئۆز-ئارا بۇلغىنىش ، يالغان ئاكتىپلارنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. بۇ ساختا ئاكتىپنى تۆۋەندىكى ئۇسۇللار ئارقىلىق ھەل قىلغىلى بولىدۇ: مەشغۇلات قىلغاندا ئېھتىياتچان ۋە مۇلايىم بولۇپ ، نىشان تەرتىپنىڭ ئەۋرىشكە مىلتىققا سۈمۈرۈلۈشى ياكى مەركەزدىن قاچۇرۇش نەيچىسىدىن ئېقىپ كېتىشىنىڭ ئالدىنى ئالىدۇ. يۇقىرى تېمپېراتۇرىغا بەرداشلىق بېرەلمەيدىغان فېرمېنت ۋە ماددىلارنى ھېسابقا ئالمىغاندا ، بارلىق رېئاكتور ياكى ئۈسكۈنىلەرنى يۇقىرى بېسىم بىلەن مىكروبسىزلاندۇرۇش كېرەك. بارلىق مەركەزدىن قاچۇرۇش تۇرۇبىسى ۋە ئەۋرىشكە ئوكۇل تۇرۇبىسىنى بىر قېتىم ئىشلىتىش كېرەك. زۆرۈر تېپىلغاندا ، رېئاكسىيە نەيچىسى ۋە رېئاكتور ئۇلترا بىنەپشە نۇر بىلەن نۇرلىنىپ ، ئەۋرىشكە قوشۇشتىن بۇرۇن بار بولغان يادرو كىسلاتاسىنى يوقىتىدۇ. ئىككىنچى ، ھاۋادىكى يادرو كىسلاتاسىنىڭ كىچىك پارچىلىرىنىڭ بۇلغىنىشى. بۇ كىچىك پارچىلار نىشان تەرتىپىدىن قىسقا ، ئەمما مەلۇم گومولوگىيەسى بار. ئۇلارنى بىر-بىرىگە چاپلىغىلى بولىدۇ ، پىرىمېرلارنى تولۇقلىغاندىن كېيىن ، PCR مەھسۇلاتلىرىنى كۈچەيتكىلى بولىدۇ ، نەتىجىدە يالغان ئاكتىپلار پەيدا بولىدۇ ، ئۇۋىسى PCR ئۇسۇلى ئارقىلىق ئازايتقىلى ياكى يوقاتقىلى بولىدۇ.

 

3. ئالاھىدە كۈچەيتمە بەلۋاغ پەيدا بولىدۇ PCR كۈچەيتىلگەندىن كېيىن پەيدا بولغان بەلۋاغ چوڭ ياكى كىچىك مۆلچەردىكى چوڭلۇق بىلەن ماس كەلمەيدۇ ، ياكى ئالاھىدە كۈچەيتمە بەلۋاغ ۋە ئالاھىدە كۈچەيتمە بەلۋاغ بىرلا ۋاقىتتا پەيدا بولىدۇ. ئېنىق بولمىغان بەلۋاغنىڭ پەيدا بولۇشىدىكى سەۋەبلەر: بىرىنچى ، پىرىماتلار نىشان تەرتىپىگە تولۇق تولۇقلانمايدۇ ، ياكى پىرىسلار توپلىنىپ ۋاقىت سىزىقىنى شەكىللەندۈرىدۇ. ئىككىنچى سەۋەب ، Mg2 + ئىئوننىڭ قويۇقلۇقى بەك يۇقىرى ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسى بەك تۆۋەن ، PCR دەۋرىيلىكى بەك كۆپ. ئىككىنچى ئامىل ئېنزىمنىڭ سۈپىتى ۋە مىقدارى. بەزى مەنبەلەردىكى ئېنزىم كۆپىنچە ئالاھىدە بەلۋاغقا مايىل بولىدۇ ، ئەمما باشقا مەنبەلەردىكى ئېنزىملار ئۇنداق بولمايدۇ. فېرمېنتنىڭ ھەددىدىن زىيادە كۆپ بولۇشى بەزىدە ئالاھىدە كۈچەيتمەسلىكنى كەلتۈرۈپ چىقىرىدۇ. تاقابىل تۇرۇش تەدبىرلىرى تۆۋەندىكىلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ: زۆرۈر تېپىلغاندا پىرىمېرلارنى قايتىدىن لايىھىلەش. ئېنزىمنىڭ مىقدارىنى ئازايتىڭ ياكى باشقا مەنبەگە ئالماشتۇرۇڭ. پىرىمېرلارنىڭ مىقدارىنى ئازايتىپ ، قېلىپنىڭ مىقدارىنى مۇۋاپىق كۆپەيتىپ ، دەۋرىيلىك سانىنى ئازايتىڭ. ئۇلاش تېمپېراتۇرىسىنى مۇۋاپىق ئۆستۈرۈڭ ياكى ئىككى تېمپېراتۇرا نۇقتىسى ئۇسۇلىنى ئىشلىتىڭ (93 سېلسىيە گرادۇسلۇق تۆۋەنلەش ، ° C 65 ئەتراپىدا كېڭەيتىش).

 

4. چاقماق سۆرەش ياكى پۈركۈش PCR كۈچەيتكۈچ بەزىدە سىرلانغان بەلۋاغ ، ۋاراققا ئوخشاش بەلۋاغ ياكى گىلەمگە ئوخشاش بەلۋاغ شەكلىدە كۆرۈنىدۇ. سەۋەبى كۆپىنچە ئېنزىمنىڭ بەك كۆپ بولۇشى ياكى سۈپىتىنىڭ ياخشى بولماسلىقى ، DNTP قويۇقلۇقىنىڭ يۇقىرى بولۇشى ، Mg2 + قويۇقلۇقىنىڭ يۇقىرى بولۇشى ، تۇتاشتۇرۇش تېمپېراتۇرىسىنىڭ تۆۋەنلىكى ۋە دەۋرىيلىكىنىڭ بەك كۆپ بولۇشىدىن كېلىپ چىقىدۇ. تاقابىل تۇرۇش تەدبىرلىرى تۆۋەندىكىلەرنى ئۆز ئىچىگە ئالىدۇ: enzyme ئېنزىمنىڭ مىقدارىنى ئازايتىش ياكى فېرمېنتنى باشقا مەنبەگە ئالماشتۇرۇش. DNTP نىڭ قويۇقلۇقىنى ئازايتىڭ. مۇۋاپىق ھالدا Mg2 + قويۇقلۇقىنى ئازايتىڭ. قېلىپلارنىڭ سانىنى كۆپەيتىپ ، دەۋرىيلىك سانىنى ئازايتىڭ