PCR Сораулар 1. Ялган тискәре, көчәйткеч полосасы күренми 2. Ялган позитив 3. Конкрет булмаган көчәйткеч полосалар барлыкка килә 4. Ябык тарту полосалары яки пычрак полосалар барлыкка килә ：

1 Ялган тискәре, көчәйтелгән полоса күренми PCR реакциясенең төп аспектлары

Nuc шаблон нуклеин кислотасы әзерләү

② төп сыйфат һәм үзенчәлек

③ ферментларның сыйфаты һәм

④ PCR цикл шартлары. Сәбәпләрен табу өчен, анализ һәм тикшеренүләр дә югарыдагы сылтамаларда үткәрелергә тиеш.

Шаблон:

① Шаблонда пычрак протеиннар бар

② Шаблонда Так фермент ингибиторы бар

The Шаблондагы протеиннар сеңдерелми һәм чыгарылмый, аеруча хромосомалардагы гистоннар

The Шаблонны чыгару һәм әзерләү вакытында бик күп югалды, яки фенол сулыш алды

N Шаблон нуклеин кислотасы тулысынча денатурацияләнмәгән. Ферментларның һәм праймерларның сыйфаты яхшы булганда, көчәйтү полосалары күренмәсә, үрнәкнең ашкайнату процессында яки шаблон нуклеин кислотасын чыгару процессында ниндидер хата бардыр. Шуңа күрә ашкайнатуның эффектив һәм тотрыклы чишелеше әзерләнергә тиеш, һәм процедура тотрыклы булырга тиеш һәм теләгәнчә үзгәртелмәскә тиеш. . Ферментны инакивацияләү: Яңа ферментны алыштырырга, яисә бер үк вакытта иске һәм яңа ферментларны кулланырга кирәк, ялган тискәре ферментларның активлыгы югалту яки булмау аркасында анализ ясау өчен. Әйтергә кирәк, кайвакыт Так ферменты онытыла. Примерлар: Пример сыйфаты, пример концентрациясе, һәм ике праймерның концентрацияләре симметрияле булу PCR уңышсызлыгы яки канәгатьләнерлек көчәйткеч полосалар һәм җиңел таралу өчен гомуми сәбәпләр. Кайбер партияләрдә пример синтезының сыйфаты белән проблемалар бар. Ике праймерның берсе югары концентрациягә, икенчесе түбән концентрациягә ия, нәтиҗәдә түбән эффективлык асимметрик көчәйтү.

Каршы чаралар:

A Яхшы пример синтез берәмлеген сайлагыз.

Prim Праймерларның концентрациясе ОД кыйммәтенә генә түгел, агароза гели электрофорезы өчен пример запас чишелешенә дә игътибар итергә тиеш. Праймер тасмалары булырга тиеш, һәм ике праймер полосасының яктылыгы якынча бер булырга тиеш. Мәсәлән, бер праймерның тасмасы, икенчесендә примерның тасмасы юк. Сызыклар өчен PCR бу вакытта уңышсыз булырга мөмкин һәм пример синтез берәмлеге белән сөйләшүләр аша чишелергә тиеш. Әгәр бер праймерның югары яктылыгы, икенчесенең түбән яктылыгы булса, праймерларны эреткәндә концентрацияләрне тигезләгез.

③ Праймерлар югары концентрациядә һәм аз күләмдә сакланырга тиеш, кат-кат туңдыру, эретү яки суыткычта озак саклану, бу праймерларның начарлануына һәм бозылуына китерергә мөмкин.

- Праймер дизайны акылсыз, мәсәлән, праймер озынлыгы җитми, праймерлар арасында димерлар барлыкка килә һ.б. Mg2 + концентрациясе: Mg2 + ион концентрациясе PCR көчәйтү эффективлыгына зур йогынты ясый. Концентрация артык зур булса, ул PCR көчәйтү үзенчәлеген киметергә мөмкин. Әгәр дә концентрация бик түбән булса, бу PCR көчәйтү уңышына тәэсир итәчәк һәм хәтта PCR көчәйтү полосаларын көчәйтмичә уңышсызлыкка китерәчәк. Реакция күләменең үзгәрүе: Гадәттә PCR көчәйтү өчен кулланылган күләмнәр 20ул, 30ул, 50ул. Яисә 100ул, PCR көчәйтү өчен нинди күләмне кулланырга кирәк, фәнни тикшеренүләр һәм клиник тестларның төрле максатлары буенча куелган. 20ул кебек кечкенә күләмне ясаганнан соң, зуррак күләм ясаганнан соң, сез шартларны үтәргә тиеш, югыйсә ул җиңел булмас. Физик сәбәпләр: PCR көчәйтү өчен денатурация бик мөһим. Денатурация температурасы түбән булса һәм денатурация вакыты кыска булса, ялган тискәре күренешләр булырга мөмкин; аннальинг температурасы бик түбән, бу специаль булмаган көчәйтүгә китерергә һәм көчәйтү эффективлыгын киметергә мөмкин. Анналь температурасы бик югары. Праймерларның шаблоннар белән бәйләнешенә бик нык тәэсир итә һәм PCR көчәйтү эффективлыгын киметә. Кайвакыт көчәйткеч яки суда эри торган чүлмәктә денатурация, анналь һәм киңәйтү температурасын тикшерү өчен стандарт термометр кулланырга кирәк. Бу шулай ук ​​PCR уңышсызлыгының бер сәбәбе. Максат эзлеклелеге вариациясе: Әгәр максат эзлеклелеге мутацияләнсә яки бетерелсә, бу праймерның шаблонга бәйләнешенә тәэсир итә, яисә праймер һәм шаблон максатчан эзлеклелекнең билгеле бер сегментын бетерү аркасында тулы эзлеклелекне югалталар, PCR көчәйтү. уңышлы булмаячак.

2. ялган позитив PCR көчәйтү полосасы максат эзлеклелеге белән туры килә, һәм кайвакыт тасма тәртиплерәк һәм яктырак. Дөрес булмаган праймериз дизайны: Сайланган көчәйтү эзлеклелеге максатсыз көчәйтү эзлеклелеге белән гомологиягә ия, шуңа күрә PCR көчәйтү эшләрен башкарганда, көчәйтелгән PCR продукты максатсыз эзлеклелек. Максатлы эзлеклелек бик кыска булса яки праймер бик кыска булса, ялган позитивлар җиңел булырга мөмкин. Праймерларны яңадан эшләргә кирәк. Максатлы эзлеклелектә яки көчәйтү продуктларында үзара пычрану: Бу пычрануның ике сәбәбе бар: Беренчедән, бөтен геномны яки зур фрагментларны үзара пычрату, ялган позитивларга китерә. Бу ялган позитивны түбәндәге ысуллар белән чишеп була: максат эзлеклелеген үрнәк мылтыкка сеңдермәсен яки центрифуга трубасыннан чыгармас өчен эшләгәндә сак һәм йомшак булыгыз. Highгары температурага каршы тора алмаган ферментлардан һәм матдәләрдән кала, барлык реагентлар яки җиһазлар югары басым белән стерилизацияләнергә тиеш. Барлык центрифуга трубалары һәм инъекция пипеткасы үрнәкләре бер тапкыр кулланылырга тиеш. Кирәк булса, реакция трубалары һәм реагентлар ультрафиолет нуры белән нурланалар, булган нуклеин кислоталарын юк итү өчен үрнәк өстәр алдыннан. Икенчесе - һавада нуклеин кислоталарының кечкенә кисәкләренең пычрануы. Бу кечкенә фрагментлар максат эзлеклелегеннән кыскарак, ләкин билгеле бер гомологиягә ия. Алар бер-берсенә бүленергә мөмкин, һәм праймерлар белән тулыландырылганнан соң, PCR продуктлары көчәйтелергә мөмкин, нәтиҗәдә ялган позитивлар барлыкка килергә мөмкин, алар ояланган PCR ысуллары белән киметелергә яки бетерелергә мөмкин.

 

3.Бер специфик көчәйткеч полосалар барлыкка килә PCR көчәйтүдән соң барлыкка килгән полосалар көтелгән зурлыкка туры килми, зуррак яки кечерәк, яисә махсус көчәйтү полосалары һәм специаль булмаган көчәйтү полосалары бер үк вакытта барлыкка килә. Конкрет булмаган полосалар барлыкка килү сәбәпләре: беренчедән, праймерлар максат эзлеклелеген тулысынча тулыландырмыйлар, яисә примерлар агрегаты үлчәмнәрне формалаштыралар. Икенче сәбәп - Mg2 + ион концентрациясе артык зур, аннальинг температурасы бик түбән, һәм PCR цикллары саны бик күп. Икенче фактор - ферментның сыйфаты һәм саны. Кайбер чыганаклардан алынган ферментлар еш кына специаль булмаган полосаларга мохтаҗ, ләкин башка чыганаклардан алынган ферментлар юк. Артык ферментлар кайвакыт специаль булмаган көчәйтүгә китерергә мөмкин. Каршы чаралар үз эченә ала: кирәк булса праймерларны яңадан проектлагыз. Фермент күләмен киметегез яки аны башка чыганак белән алыштырыгыз. Праймерлар күләмен киметү, шаблон күләмен тиешенчә арттыру, цикллар санын киметү. Анналь температураны тиешенчә күтәрегез яки ике температура ноктасын кулланыгыз (93 ° C температурада денатурация, аннальлау һәм 65 ° C тирәсе киңәйтү).

 

. Сәбәпләре еш кына ферментларның артык күп булуы яки ферментларның сыйфатсызлыгы, артык зур DNTP концентрациясе, артык югары Mg2 + концентрациясе, бик түбән анналь температурасы һәм бик күп цикллар аркасында килеп чыга. Каршы чаралар үз эченә ала: enzyme Фермент күләмен киметү, яки ферментны башка чыганакка алыштыру. D DNTP концентрациясен киметү. Mg2 + концентрациясен тиешенчә киметегез. Шаблоннар күләмен арттыру һәм цикл санын киметү