PCR SSS 1. Yanlış negatif, amplifikasyon bandı görünmüyor 2. Yanlış pozitif 3. Spesifik olmayan amplifikasyon bantları görünüyor 4. Kesintili sürükleme şeritleri veya smear şeritleri görünüyor:
1Yanlış negatif, güçlendirilmiş bant görünmüyor PCR reaksiyonunun temel yönleri şunlardır:
① şablon nükleik asidin hazırlanması
② astar kalitesi ve özgüllüğü
③ enzim kalitesi ve
④ PCR döngüsü koşulları. Sebeplerini bulmak için yukarıdaki bağlantılarda da analiz ve araştırma yapılması gerekmektedir.
Şablon:
① Şablon safsızlık proteinleri içeriyor
② Şablon Taq enzim inhibitörlerini içerir
③ Şablondaki proteinler, özellikle kromozomlardaki histonlar sindirilmez ve uzaklaştırılmaz.
④ Şablonun ekstraksiyonu ve hazırlanması sırasında çok fazla kayıp oldu veya fenol solundu
⑤Şablon nükleik asit tamamen denatüre değildir. Enzimlerin ve primerlerin kalitesi iyi olduğunda amplifikasyon bantları görünmüyorsa büyük olasılıkla numunenin sindirim sürecinde veya şablon nükleik asit ekstraksiyon sürecinde bir sorun vardır. Bu nedenle etkili ve stabil bir sindirim solüsyonu hazırlanmalı, prosedür sabitlenmeli ve istenildiği gibi değiştirilmemelidir. . Enzim inaktivasyonu: Yanlış negatiflerin kayıptan mı yoksa yetersiz enzim aktivitesinden mi kaynaklandığını analiz etmek için yeni enzimin değiştirilmesi veya hem eski hem de yeni enzimlerin aynı anda kullanılması gerekir. Bazen Taq enziminin unutulduğuna dikkat edilmelidir. Primerler: Primer kalitesi, primer konsantrasyonu ve iki primerin konsantrasyonunun simetrik olup olmadığı, PCR başarısızlığının veya yetersiz amplifikasyon bantlarının ve kolay difüzyonun yaygın nedenleridir. Bazı partilerde primer sentezinin kalitesiyle ilgili sorunlar var. İki primerden biri yüksek konsantrasyona, diğeri düşük konsantrasyona sahiptir, bu da düşük verimli asimetrik amplifikasyona neden olur.
Karşı önlemler şunlardır:
① İyi bir primer sentez ünitesi seçin.
② Primerlerin konsantrasyonu sadece OD değerine bakmamalı, aynı zamanda agaroz jel elektroforezi için primer stok çözeltisine de dikkat etmelidir. Astar bantlar olmalı ve iki astar bandın parlaklığı kabaca aynı olmalıdır. Örneğin bir primerin bantı varken diğerinin bantı yoktur. Stripler için PCR şu anda başarısız olabilir ve primer sentez ünitesi ile görüşülerek çözülmelidir. Bir astarın parlaklığı yüksek, diğerinin parlaklığı düşükse astarları seyreltirken konsantrasyonları dengeleyin.
③ Primerlerin bozulmasına ve bozunmasına yol açabilecek tekrarlanan donma ve çözülme veya buzdolabında uzun süreli saklamayı önlemek için primerler yüksek konsantrasyonda ve küçük miktarlarda saklanmalıdır.
④Primer tasarımı mantıksız, örneğin primer uzunluğu yeterli değil, primerler arasında dimerler oluşuyor vb. Mg2+ konsantrasyonu: Mg2+ iyon konsantrasyonunun PCR amplifikasyon verimliliği üzerinde büyük etkisi vardır. Konsantrasyon çok yüksekse PCR amplifikasyonunun özgüllüğü azalabilir. Konsantrasyon çok düşükse PCR amplifikasyon verimini etkileyecek ve hatta PCR amplifikasyonunun bantları amplifiye etmeden başarısız olmasına neden olacaktır. Reaksiyon hacmindeki değişiklikler: Genellikle PCR amplifikasyonu için kullanılan hacimler 20ul, 30ul ve 50ul'dur. Veya 100ul, PCR amplifikasyonu için hangi hacmin kullanılması gerektiği, bilimsel araştırma ve klinik testlerin farklı amaçlarına göre ayarlanır. 20ul gibi küçük bir hacim yaptıktan sonra daha büyük bir hacim yaptıktan sonra şartlara uymanız gerekir, aksi takdirde kolayca arızalanır. Fiziksel nedenler: PCR amplifikasyonu için denatürasyon çok önemlidir. Denatürasyon sıcaklığı düşükse ve denatürasyon süresi kısaysa, yanlış negatiflerin meydana gelme olasılığı çok yüksektir; tavlama sıcaklığı çok düşük, bu da spesifik olmayan amplifikasyona neden olabilir ve spesifik amplifikasyon verimliliğini azaltabilir. Tavlama sıcaklığı çok yüksek. Primerlerin şablonlara bağlanmasını büyük ölçüde etkiler ve PCR amplifikasyon verimliliğini azaltır. Bazen amplifikatördeki veya suda çözünür kaptaki denatürasyon, tavlama ve uzatma sıcaklıklarını kontrol etmek için standart bir termometre kullanmak gerekir. Bu aynı zamanda PCR başarısızlığının nedenlerinden biridir. Hedef dizi varyasyonu: Hedef dizi mutasyona uğramış veya silinmişse, bu durum primerin şablona spesifik bağlanmasını etkilerse veya hedef dizinin belirli bir bölümünün silinmesi nedeniyle primer ve şablon tamamlayıcı diziyi kaybederse, PCR amplifikasyonu başarılı olmayacak.
2.yanlış pozitif Görünen PCR amplifikasyon bandı, hedef dizi bandıyla tutarlıdır ve bazen bant daha düzenli ve daha parlaktır. Uygunsuz primer tasarımı: Seçilen amplifikasyon sekansı, hedef olmayan amplifikasyon sekansı ile homolojiye sahiptir, dolayısıyla PCR amplifikasyonu gerçekleştirirken amplifiye PCR ürünü, hedef olmayan bir sekanstır. Hedef dizi çok kısaysa veya primer çok kısaysa yanlış pozitifler kolaylıkla meydana gelebilir. Primerlerin yeniden tasarlanması gerekiyor. Hedef dizilerin veya amplifikasyon ürünlerinin çapraz kontaminasyonu: Bu kontaminasyonun iki nedeni vardır: Birincisi, tüm genomun veya büyük parçaların çapraz kontaminasyonu, yanlış pozitiflere yol açar. Bu hatalı pozitiflik aşağıdaki yöntemlerle çözülebilir: Hedef sekansın numune tabancasına çekilmesini veya santrifüj tüpünden dışarı sıçramasını önlemek için çalışırken dikkatli ve nazik olun. Yüksek sıcaklıklara dayanamayan enzimler ve maddeler dışında tüm reaktifler veya ekipmanlar yüksek basınçla sterilize edilmelidir. Tüm santrifüj tüpleri ve numune enjeksiyon pipet uçları bir kez kullanılmalıdır. Gerekirse, mevcut nükleik asitleri yok etmek için numuneyi eklemeden önce reaksiyon tüpleri ve reaktifler ultraviyole ışıkla ışınlanır. İkincisi, havadaki küçük nükleik asit parçacıklarının kirlenmesidir. Bu küçük parçalar hedef diziden daha kısadır ancak belirli bir homolojiye sahiptir. Birbirlerine eklenebilirler ve primerleri tamamlayıcı hale geldikten sonra PCR ürünleri çoğaltılabilir, bu da yanlış pozitiflerle sonuçlanabilir ve bu durum iç içe PCR yöntemleriyle azaltılabilir veya ortadan kaldırılabilir.
3.Spesifik olmayan amplifikasyon bantları görünüyor PCR amplifikasyonundan sonra ortaya çıkan bantlar, beklenen boyutla tutarsız, daha büyük veya daha küçük veya hem spesifik amplifikasyon bantları hem de spesifik olmayan amplifikasyon bantları aynı anda görünüyor. Spesifik olmayan bantların ortaya çıkmasının nedenleri şunlardır: birincisi, primerler hedef diziye tamamen tamamlayıcı değildir veya primerler dimerler oluşturmak üzere bir araya gelir. İkinci neden ise Mg2+ iyon konsantrasyonunun çok yüksek olması, tavlama sıcaklığının çok düşük olması ve PCR döngü sayısının çok fazla olmasıdır. İkinci faktör enzimin kalitesi ve miktarıdır. Bazı kaynaklardan gelen enzimler genellikle spesifik olmayan bantlara eğilimlidir ancak diğer kaynaklardan gelen enzimler bu eğilime sahip değildir. Aşırı miktarda enzim bazen spesifik olmayan amplifikasyona yol açabilir. Karşı önlemler şunları içerir: Gerekirse primerleri yeniden tasarlayın. Enzim miktarını azaltın veya başka bir kaynakla değiştirin. Astar miktarını azaltın, şablon miktarını uygun şekilde artırın ve döngü sayısını azaltın. Tavlama sıcaklığını uygun şekilde artırın veya iki sıcaklık noktası yöntemini kullanın (93°C'de denatürasyon, tavlama ve 65°C civarında uzatma).
4. Pul pul dökülme veya lekeler görünüyor PCR amplifikasyonu bazen lekeli bantlar, tabaka benzeri bantlar veya halı benzeri bantlar şeklinde görünür. Sebepler genellikle çok fazla enzim veya düşük enzim kalitesi, çok yüksek dNTP konsantrasyonu, çok yüksek Mg2+ konsantrasyonu, çok düşük tavlama sıcaklığı ve çok fazla döngüden kaynaklanır. Karşı önlemler şunları içerir: ① Enzim miktarını azaltın veya enzimi başka bir kaynakla değiştirin. ②dNTP konsantrasyonunu azaltın. Mg2+ konsantrasyonunu uygun şekilde azaltın. Şablon miktarını artırın ve döngü sayısını azaltın
