FAQ ng PCR 1. False negative, walang amplification band na lumalabas 2. False positive 3. Non-specific amplification bands lumalabas 4. Flaky drag strips o smear strips lalabas：

1Maling negatibo, walang lumalabas na banda na may amplified Ang mga pangunahing aspeto ng reaksyon ng PCR ay

① paghahanda ng template nucleic acid

② primer na kalidad at pagtitiyak

③ kalidad ng enzyme at

④ Mga kondisyon ng PCR cycle. Upang mahanap ang mga dahilan, ang pagsusuri at pananaliksik ay dapat ding isagawa sa mga link sa itaas.

Template:

① Ang template ay naglalaman ng mga impurity protein

② Ang template ay naglalaman ng Taq enzyme inhibitors

③ Ang mga protina sa template ay hindi natutunaw at inalis, lalo na ang mga histone sa mga chromosome

④ Napakaraming nawala sa panahon ng pagkuha at paghahanda ng template, o nalalanghap ang phenol

⑤Ang template na nucleic acid ay hindi ganap na na-denatured. Kapag ang kalidad ng mga enzyme at primer ay mabuti, kung ang mga amplification band ay hindi lilitaw, ito ay malamang na may isang bagay na mali sa proseso ng panunaw ng ispesimen o ang template na proseso ng pagkuha ng nucleic acid. Samakatuwid, ang isang epektibo at matatag na solusyon sa panunaw ay dapat na ihanda, at ang pamamaraan ay dapat na maayos at hindi dapat baguhin sa kalooban. . Enzyme inactivation: Kinakailangang palitan ang bagong enzyme, o gamitin ang parehong luma at bagong enzymes sa parehong oras upang suriin kung ang mga maling negatibo ay sanhi ng pagkawala o hindi sapat na aktibidad ng enzyme. Dapat pansinin na kung minsan ay nalilimutan ang Taq enzyme. Mga primer: Ang kalidad ng panimulang aklat, ang konsentrasyon ng panimulang aklat, at kung simetriko ang mga konsentrasyon ng dalawang panimulang aklat ay karaniwang mga dahilan para sa pagkabigo ng PCR o hindi kasiya-siyang amplification band at madaling pagsasabog. May mga problema sa kalidad ng primer synthesis sa ilang batch. Ang isa sa dalawang panimulang aklat ay may mataas na konsentrasyon at ang isa ay may mababang konsentrasyon, na nagreresulta sa mababang kahusayan na asymmetric amplification.

Ang mga countermeasure ay:

① Pumili ng magandang primer synthesis unit.

② Ang konsentrasyon ng mga panimulang aklat ay hindi lamang dapat tumingin sa halaga ng OD, ngunit bigyang-pansin din ang panimulang solusyon ng stock para sa agarose gel electrophoresis. Dapat mayroong mga primer na banda, at ang liwanag ng dalawang primer na banda ay dapat na halos pareho. Halimbawa, ang isang panimulang aklat ay may banda at ang isa pang panimulang aklat ay walang banda. Para sa mga strip, maaaring mabigo ang PCR sa oras na ito at dapat malutas sa pamamagitan ng negosasyon sa primer synthesis unit. Kung ang isang panimulang aklat ay may mataas na liwanag at ang isa ay may mababang liwanag, balansehin ang mga konsentrasyon kapag nagpapalabnaw sa mga panimulang aklat.

③ Ang mga panimulang aklat ay dapat na nakaimbak sa mataas na konsentrasyon at maliit na dami upang maiwasan ang paulit-ulit na pagyeyelo at lasaw o pangmatagalang imbakan sa refrigerator, na maaaring humantong sa pagkasira at pagkasira ng mga panimulang aklat.

④Ang disenyo ng panimulang aklat ay hindi makatwiran, tulad ng hindi sapat na haba ng panimulang aklat, nabubuo ang mga dimer sa pagitan ng mga panimulang aklat, atbp. Konsentrasyon ng Mg2+: Ang konsentrasyon ng ion ng Mg2+ ay may malaking impluwensya sa kahusayan ng PCR amplification. Kung ang konsentrasyon ay masyadong mataas, maaari nitong bawasan ang pagtitiyak ng PCR amplification. Kung ang konsentrasyon ay masyadong mababa, ito ay makakaapekto sa PCR amplification yield at maging sanhi ng PCR amplification na mabigo nang walang amplifying bands. Mga pagbabago sa dami ng reaksyon: Karaniwan ang mga volume na ginagamit para sa PCR amplification ay 20ul, 30ul, at 50ul. O 100ul, kung anong volume ang dapat gamitin para sa PCR amplification ay itinakda ayon sa iba't ibang layunin ng siyentipikong pananaliksik at klinikal na pagsubok. Pagkatapos gumawa ng isang maliit na volume, tulad ng 20ul, at pagkatapos ay gumawa ng mas malaking volume, dapat mong sundin ang mga kondisyon, kung hindi, ito ay madaling mabibigo. Mga pisikal na dahilan: Napakahalaga ng denaturation para sa PCR amplification. Kung ang temperatura ng denaturation ay mababa at ang oras ng denaturation ay maikli, ang mga maling negatibo ay malamang na mangyari; ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mababa, na maaaring magdulot ng hindi tiyak na amplification at bawasan ang tiyak na kahusayan ng amplification. Ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mataas. Lubos na nakakaapekto sa pagbubuklod ng mga panimulang aklat sa mga template at binabawasan ang kahusayan sa amplification ng PCR. Minsan kinakailangan na gumamit ng karaniwang thermometer upang suriin ang denaturation, annealing at extension na temperatura sa amplifier o water-soluble pot. Isa rin ito sa mga dahilan ng pagkabigo ng PCR. Variation ng target na sequence: Kung ang target na sequence ay na-mutate o na-delete, na nakakaapekto sa partikular na pag-binding ng primer sa template, o nawala sa primer at template ang complementary sequence dahil sa pagtanggal ng isang partikular na segment ng target na sequence, ang PCR amplification hindi magiging matagumpay.

2.false positive Ang PCR amplification band na lumalabas ay pare-pareho sa target na sequence band, at kung minsan ang banda ay mas maayos at mas maliwanag. Hindi naaangkop na primer na disenyo: Ang napiling amplification sequence ay may homology na may non-target na amplification sequence, kaya kapag nagsasagawa ng PCR amplification, ang amplified PCR product ay isang non-target na sequence. Kung ang target na sequence ay masyadong maikli o ang panimulang aklat ay masyadong maikli, ang mga maling positibo ay maaaring madaling mangyari. Ang mga panimulang aklat ay kailangang muling idisenyo. Cross-contamination ng mga target na sequence o amplification na produkto: Mayroong dalawang dahilan para sa contamination na ito: Una, cross-contamination ng buong genome o malalaking fragment, na humahantong sa mga false positive. Ang maling positibong ito ay maaaring malutas sa pamamagitan ng mga sumusunod na pamamaraan: Maging maingat at banayad kapag nagpapatakbo upang maiwasan ang target na sequence na masipsip sa sample na baril o tumalsik palabas ng centrifuge tube. Maliban sa mga enzyme at substance na hindi makatiis sa mataas na temperatura, ang lahat ng reagents o kagamitan ay dapat na isterilisado ng mataas na presyon. Lahat ng centrifuge tubes at sample injection pipette tip ay dapat gamitin nang isang beses. Kung kinakailangan, ang mga reaction tubes at reagents ay pinaiinitan ng ultraviolet light bago idagdag ang specimen upang sirain ang mga nucleic acid na naroroon. Ang pangalawa ay ang kontaminasyon ng maliliit na fragment ng nucleic acid sa hangin. Ang maliliit na fragment na ito ay mas maikli kaysa sa target na sequence, ngunit may ilang partikular na homology. Maaari silang idugtong sa isa't isa, at pagkatapos na maging komplementaryo sa mga panimulang aklat, ang mga produkto ng PCR ay maaaring palakihin, na magreresulta sa mga maling positibo, na maaaring bawasan o alisin sa pamamagitan ng mga nested PCR na pamamaraan.

 

3. Lumilitaw ang mga hindi partikular na amplification band Ang mga banda na lumilitaw pagkatapos ng PCR amplification ay hindi naaayon sa inaasahang laki, mas malaki man o mas maliit, o parehong lumalabas ang parehong partikular na amplification band at hindi partikular na amplification band. Ang mga dahilan para sa paglitaw ng mga di-tiyak na banda ay: una, ang mga panimulang aklat ay hindi ganap na komplementaryo sa target na pagkakasunud-sunod, o ang mga panimulang aklat ay pinagsama-sama upang bumuo ng mga dimer. Ang pangalawang dahilan ay ang konsentrasyon ng Mg2+ ion ay masyadong mataas, ang temperatura ng pagsusubo ay masyadong mababa, at ang bilang ng mga PCR cycle ay masyadong mataas. Ang pangalawang kadahilanan ay ang kalidad at dami ng enzyme. Ang mga enzyme mula sa ilang pinagmumulan ay kadalasang madaling kapitan ng mga di-tiyak na banda ngunit ang mga enzyme mula sa ibang mga pinagmumulan ay hindi. Ang sobrang dami ng mga enzyme ay minsan ay maaaring humantong sa hindi tiyak na amplification. Kasama sa mga hakbang ang: muling idisenyo ang mga panimulang aklat kung kinakailangan. Bawasan ang dami ng enzyme o palitan ito ng ibang pinagmulan. Bawasan ang dami ng mga panimulang aklat, dagdagan ang dami ng template nang naaangkop, at bawasan ang bilang ng mga cycle. Taasan ang temperatura ng pagsusubo nang naaangkop o gamitin ang dalawang-temperatura na paraan ng punto (denaturasyon sa 93°C, pagsusubo at extension sa paligid ng 65°C).

 

4. Lumilitaw ang flaky drag o smear na PCR amplification kung minsan ay lumilitaw bilang smeared bands, sheet-like bands o carpet-like bands. Ang mga dahilan ay kadalasang sanhi ng labis na enzyme o mahinang kalidad ng enzyme, masyadong mataas na konsentrasyon ng dNTP, masyadong mataas na konsentrasyon ng Mg2+, masyadong mababa ang temperatura ng pagsusubo, at napakaraming cycle. Kasama sa mga hakbang ang: ① Bawasan ang dami ng enzyme, o palitan ang enzyme ng ibang pinagmulan. ②Bawasan ang konsentrasyon ng dNTP. Naaangkop na bawasan ang konsentrasyon ng Mg2+. Dagdagan ang dami ng mga template at bawasan ang bilang ng mga cycle