PCR soraglary 1. sealňyş negatiw, güýçlendiriji zolak peýda bolmaýar 2. sealňyş polo positiveitel 3. specificörite däl güýçlendiriji zolaklar peýda bolýar 4. ackalpyldawuk süýüm zolaklary ýa-da reňkli zolaklar peýda bolýar ：
1 sealňyş negatiw, güýçlendirilen zolak peýda bolmaýar PCR reaksiýasynyň esasy taraplary
Temple şablon nuklein kislotasyny taýýarlamak
② başlangyç hili we aýratynlygy
③ fermentleriň hili we
④ PCR sikl şertleri. Sebäplerini tapmak üçin ýokardaky baglanyşyklarda derňew we gözlegler hem geçirilmelidir.
Şablon:
① Şablonda hapa beloklar bar
② Şablonda Taq ferment ingibitorlary bar
The Şablondaky beloklar siňdirilmeýär we aýrylmaýar, esasanam hromosomlardaky gistonlar
The Şablony çykarmak we taýýarlamak wagtynda gaty köp zat ýitirildi ýa-da fenol dem aldy
Temp Şablon nuklein kislotasy doly denatirlenenok. Fermentleriň we primerleriň hili gowy bolanda, güýçlendiriji zolaklar peýda bolmasa, nusganyň siňdiriş prosesinde ýa-da şablonyň nuklein kislotasyny çykarmakda näsazlyk bar bolmagy ähtimal. Şonuň üçin iýmit siňdirişiň täsirli we durnukly çözgüdi taýýarlanylmaly we prosedura kesgitlenmeli we isleg boýunça üýtgedilmeli däl. . Fermentleri hereketsizleşdirmek: Täze fermenti çalyşmak ýa-da ýalan negatiwleriň ferment işjeňliginiň ýitmegi ýa-da ýeterlik däldigi sebäpli analiz etmek üçin köne we täze fermentleri bir wagtyň özünde ulanmak zerurdyr. Käwagt Taq fermentiniň ýatdan çykarylýandygyny bellemelidiris .Primerler: Esasy hil, başlangyç konsentrasiýa we iki primeriň konsentrasiýasynyň simmetrikdigi PCR şowsuzlygynyň ýa-da kanagatlanarly güýçlendirme zolaklarynyň we aňsat ýaýramagynyň umumy sebäpleridir. Käbir toparlarda primer sinteziniň hili bilen baglanyşykly meseleler bar. Iki desganyň birinde ýokary konsentrasiýa, beýlekisinde pes konsentrasiýa bar, netijede pes netijelilik asimmetrik güýçlendirilýär.
Garşylyk çäreleri:
A Gowy primer sintez bölümini saýlaň.
Prim Primerleriň konsentrasiýasy diňe bir OD bahasyna seretmeli däl, eýsem agarose gel elektroforezi üçin başlangyç ätiýaçlyk çözgüdine hem üns bermeli. Astar zolaklary bolmaly we iki başlangyç zolagyň ýagtylygy takmynan birmeňzeş bolmaly. Mysal üçin, bir primeriň zolagy, beýlekisinde primer ýok. Zolaklar üçin PCR bu wagt şowsuz bolup biler we başlangyç sintez bölümi bilen gepleşikler arkaly çözülmelidir. Bir primeriň ýokary ýagtylygy, beýlekisiniň pes ýagtylygy bar bolsa, primerleri suwuklanda konsentrasiýalary deňleşdiriň.
③ Astarlaryň ýaramazlaşmagyna we zaýalanmagyna sebäp bolup bilýän, doňdurmagyň we eremegiň ýa-da holodilnikde uzak wagtlap saklanmagynyň öňüni almak üçin primerler ýokary konsentrasiýada we az mukdarda saklanmalydyr.
PrimAzuw dizaýny esassyz, meselem asmanyň uzynlygy ýeterlik däl, primerleriň arasynda ölçegler emele gelýär we ş.m. Mg2 + konsentrasiýasy: Mg2 + ion konsentrasiýasy PCR güýçlendirmek netijeliligine uly täsir edýär. Eger konsentrasiýa gaty ýokary bolsa, PCR güýçlendirmek aýratynlygyny peseldip biler. Konsentrasiýa gaty pes bolsa, PCR güýçlendirme hasylyna täsir eder we hatda PCR güýçlendirme zolaklaryny güýçlendirmezden şowsuz bolmagyna sebäp bolar. Reaksiýanyň göwrüminiň üýtgemegi: Adatça PCR güýçlendirmek üçin ulanylýan göwrümler 20ul, 30ul we 50ul bolýar. Ora-da 100ul, PCR güýçlendirmek üçin haýsy göwrümi ulanmalydygy ylmy gözlegleriň we kliniki synaglaryň dürli maksatlaryna laýyklykda kesgitlenýär. 20ul ýaly kiçijik göwrüm ýasap, soňra has uly ses çykaranyňyzdan soň şertleri ýerine ýetirmeli, ýogsam aňsatlyk bilen şowsuz bolar. Fiziki sebäpler: PCR güýçlendirmek üçin denaturasiýa gaty möhümdir. Denaturasiýanyň temperaturasy pes bolsa we denatasiýa wagty gysga bolsa, ýalan negatiwleriň ýüze çykmagy gaty ähtimal; mahsus bolmadyk güýçlendirme sebäp bolup, güýçlendirme netijeliligini peseldip bilýän gyzdyryjy temperatura gaty pesdir. Düwürtik temperaturasy gaty ýokary. Primerleriň şablonlar bilen baglanyşygyna ýokary derejede täsir edýär we PCR güýçlendirmek netijeliligini peseldýär. Kämahal güýçlendirijide ýa-da suwda erän gazanda denaturasiýany, gyzdyrmagy we uzaldyş temperaturasyny barlamak üçin adaty termometri ulanmaly bolýar. Bu hem PCR şowsuzlygynyň sebäplerinden biridir. Maksat yzygiderliliginiň üýtgemegi: Maksadyň yzygiderliligi üýtgedilen ýa-da öçürilen bolsa, bu primeriň şablona bagly bolmagyna täsir edýän bolsa ýa-da primer we şablon maksat yzygiderliliginiň belli bir böleginiň ýok edilmegi, PCR güýçlendirilmegi sebäpli goşmaça yzygiderliligi ýitirse. üstünlikli bolmaz.
2. ýalňyş polo positiveitel peýda bolan PCR güýçlendirme zolagy maksat yzygiderliligine laýyk gelýär, käwagt bolsa zolak has tertipli we ýagty bolýar. Opriateerliksiz başlangyç dizaýn: Saýlanan güýçlendirme yzygiderliligi maksatly güýçlendirme yzygiderliligi bilen gomologiýa eýe, şonuň üçin PCR güýçlendirme ýerine ýetirilende güýçlendirilen PCR önümi maksatly däl yzygiderlilikdir. Maksat yzygiderliligi gaty gysga bolsa ýa-da primer gaty gysga bolsa, ýalan pozitiwler aňsatlyk bilen ýüze çykyp biler. Primerleri täzeden dizaýn etmeli. Maksat yzygiderliliginiň ýa-da güýçlendiriji önümleriň biri-biri bilen hapalanmagy: Bu hapalanmagyň iki sebäbi bar: Birinjiden, tutuş genomyň ýa-da uly bölekleriň biri-biri bilen hapalanmagy, ýalan pozitiwlere sebäp bolýar. Bu ýalan polo positiveitel aşakdaky usullar bilen çözülip bilner: Maksat yzygiderliliginiň nusga ýaragyna siňmeginiň ýa-da merkezden gaçyryş turbasynyň daşyna çykmagynyň öňüni almak üçin seresap we mylaýym boluň. Highokary temperatura çydap bilmeýän fermentlerden we maddalardan başga ähli reagentler ýa-da enjamlar ýokary basyş bilen sterilizasiýa edilmelidir. Centhli sentrifuga turbalary we sanjym turbasynyň nusgalary bir gezek ulanylmaly. Zerur bolsa, bar bolan nuklein kislotalary ýok etmek üçin nusga goşmazdan ozal reaksiýa turbalary we reagentler ultramelewşe şöhle bilen şöhlelenýär. Ikinjisi, howadaky nuklein kislotalarynyň ownuk bölekleriniň hapalanmagy. Bu ownuk bölekler maksat yzygiderliliginden gysga, ýöne belli bir gomologiýa eýe. Olary biri-birine bölüp bolýar we desgalar bilen üsti ýetirilenden soň, PCR önümleri güýçlendirilip bilner, netijede ýalan pozitiwlere sebäp bolup, öýjükli PCR usullary bilen azaldylyp ýa-da ýok edilip bilner.
3. Aýratyn güýçlendirme zolaklary peýda bolýar PCR güýçlendirilenden soň peýda bolan zolaklar garaşylýan ululyga laýyk gelmeýär, uly ýa-da kiçi, ýa-da ýörite güýçlendiriji zolaklar we ýörite däl güýçlendirme zolaklary bir wagtda peýda bolýar. Specificörite däl zolaklaryň peýda bolmagynyň sebäpleri: birinjiden, desgalar maksat yzygiderliligi bilen doly däl ýa-da ölçegleri emele getirýän primerler jemlenýär. Ikinji sebäp, Mg2 + ion konsentrasiýasynyň aşa ýokary bolmagy, gyzdyrmagyň temperaturasy gaty pes we PCR siklleriniň sany gaty köp. Ikinji faktor fermentiň hili we mukdarydyr. Käbir çeşmelerden alynýan fermentler köplenç belli bolmadyk zolaklara ýykgyn edýärler, ýöne beýleki çeşmelerden fermentler ýok. Fermentleriň aşa köp bolmagy käwagt ýörite däl güýçlendirilmegine sebäp bolup biler. Garşylyk çäreleri şulary öz içine alýar: zerur bolsa primerleri täzeden düzüň. Fermentiň mukdaryny azaldyň ýa-da başga bir çeşme bilen çalşyň. Astarlaryň mukdaryny azaltmak, şablonyň mukdaryny köpeltmek we aýlawlaryň sanyny azaltmak. Düwürtme temperaturasyny ýerlikli ýokarlandyryň ýa-da iki temperaturaly nokat usulyny ulanyň (93 ° C-de denaturasiýa, anneal we 65 ° C töweregi uzalma).
4.Falky süýräp ýa-da çalmak PCR güýçlendirme käwagt çal reňkli zolaklar, liste meňzeş zolaklar ýa-da haly ýaly zolaklar ýaly görünýär. Munuň sebäpleri köplenç fermentiň aşa köp bolmagy ýa-da fermentiň hiliniň pesligi, aşa ýokary DNTP konsentrasiýasy, aşa ýokary Mg2 + konsentrasiýasy, aşa pes temperatura we gaty köp sikl bilen ýüze çykýar. Garşylyk çäreleri şulary öz içine alýar: enzyme Fermentiň mukdaryny azaltmak ýa-da fermenti başga çeşme bilen çalyşmak. D DNTP konsentrasiýasyny azaltmak. Mg2 + konsentrasiýasyny ýerlikli azaldyň. Şablonlaryň mukdaryny köpeltmek we aýlawlaryň sanyny azaltmak
