การแยกและการทำให้โปรตีนบริสุทธิ์ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายในการวิจัยและการประยุกต์ทางชีวเคมี และเป็นทักษะการปฏิบัติงานที่สำคัญ เซลล์ยูคาริโอตทั่วไปสามารถประกอบด้วยโปรตีนต่างๆ นับพันชนิด บางชนิดมีความเข้มข้นมากและบางชนิดมีเพียงไม่กี่สำเนาเท่านั้น เพื่อที่จะศึกษาดูบ้างโปรตีนจำเป็นต้องทำให้โปรตีนบริสุทธิ์จากโปรตีนอื่นและโมเลกุลที่ไม่ใช่โปรตีนก่อน

1. วิธีการเอาเกลือออกโปรตีน:

เกลือที่เป็นกลางมีผลอย่างมากต่อความสามารถในการละลายของโปรตีน โดยทั่วไป เมื่อความเข้มข้นของเกลือเพิ่มขึ้นภายใต้ความเข้มข้นของเกลือต่ำ ความสามารถในการละลายของโปรตีนจะเพิ่มขึ้น สิ่งนี้เรียกว่าการทำเกลือ เมื่อความเข้มข้นของเกลือเพิ่มขึ้นอย่างต่อเนื่อง ความสามารถในการละลายของโปรตีนจะลดลงเป็นองศาที่แตกต่างกันและแยกตัวออกจากกัน ปรากฏการณ์นี้เรียกว่าเกลือออก

2. วิธีการซ้อนจุดไอโซอิเล็กทริก:

การผลักกันของไฟฟ้าสถิตระหว่างอนุภาคจะน้อยที่สุดเมื่อโปรตีนคงที่ ดังนั้นความสามารถในการละลายจึงน้อยที่สุดเช่นกัน จุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีนต่างๆแตกต่างกัน ค่า pH ของสารละลายปรับสภาพสามารถใช้เพื่อให้ถึงจุดไอโซอิเล็กทริกของโปรตีน ทำให้มีการสะสม แต่วิธีนี้ไม่ค่อยได้ใช้เพียงอย่างเดียวและสามารถใช้ร่วมกับวิธีเติมเกลือได้

3. การฟอกไตและการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชัน:

การฟอกไตใช้เมมเบรนแบบกึ่งซึมผ่านได้เพื่อแยกโปรตีนที่มีขนาดโมเลกุลต่างกัน วิธีการกรองแบบอัลตราฟิลเตรชันใช้แรงดันสูงหรือแรงเหวี่ยงเพื่อทำให้น้ำและโมเลกุลของตัวถูกละลายขนาดเล็กอื่นๆ ผ่านเมมเบรนแบบกึ่งซึมผ่านได้ ในขณะที่โปรตีนยังคงอยู่บนเมมเบรน คุณสามารถเลือกขนาดรูพรุนที่แตกต่างกันเพื่อสกัดกั้นโปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่างกันได้

4.วิธีการกรองเจล:

เรียกอีกอย่างว่าโครมาโตกราฟีแบบแยกขนาดหรือโครมาโตกราฟีแบบตะแกรงโมเลกุล ซึ่งเป็นหนึ่งในวิธีการที่มีประโยชน์มากที่สุดในการแยกส่วนผสมโปรตีนตามขนาดโมเลกุล วัสดุบรรจุภัณฑ์ที่ใช้กันทั่วไปในคอลัมน์คือเจลกลูโคส (Sephadex ged) และเจลอะกาโรส (เจลอะกาโรส)

5.อิเล็กโตรโฟเรซิส:

ภายใต้สภาวะ pH เดียวกัน โปรตีนหลายชนิดสามารถแยกออกจากกันเนื่องจากน้ำหนักโมเลกุลและประจุในสนามไฟฟ้าต่างกัน ควรให้ความสนใจกับอิเล็กโตรโฟรีซิสชุดไอโซอิเล็กทริกซึ่งใช้แอมโฟไลต์เป็นตัวพา ในระหว่างอิเล็กโตรโฟเรซิส แอมโฟไลต์จะค่อยๆ เพิ่มระดับ pH จากอิเล็กโทรดบวกไปยังอิเล็กโทรดลบ เมื่อโปรตีนที่มีประจุจำนวนหนึ่งแหวกว่ายอยู่ มันก็จะไปถึงกัน ตำแหน่ง pH ของจุดทางไฟฟ้าไม่ต่อเนื่อง และวิธีการนี้สามารถใช้ในการวิเคราะห์และเตรียมโปรตีนต่างๆ

6.โครมาโตกราฟีการสื่อสารด้วยไอออน:

สารสื่อสารไอออนรวมถึงสารสื่อสารประจุบวก (เช่น คาร์บอกซีเมทิลเซลลูโลส; CM-เซลลูโลส) และสารสื่อสารประจุลบ (ไดเอทิลอะมิโนเอทิลเซลลูโลส) เมื่อผ่านคอลัมน์โครมาโตกราฟีการสื่อสารด้วยไอออน โปรตีนที่มีประจุตรงข้ามกับสารสื่อสารไอออนจะถูกดูดซับบนสารสื่อสารไอออน จากนั้นจะถูกดูดซับโปรตีนถูกชะออกโดยการเปลี่ยนค่า pH หรือความแรงของไอออนิก

7. โครมาโตกราฟีแบบความสัมพันธ์:

อัฟฟินิตี้โครมาโทกราฟีเป็นวิธีการที่มีประโยชน์อย่างยิ่งในการแยกโปรตีน มักจะต้องใช้ขั้นตอนเดียวในการแยกโปรตีนบางชนิดออกจากส่วนผสมโปรตีนที่ยุ่งเหยิงและมีความบริสุทธิ์สูง

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการจับกันของโปรตีนบางชนิดกับโมเลกุลอื่นที่เรียกว่าลิแกนด์ (ลิแกนด์) มากกว่าการจับด้วยโควาเลนต์

หลักการพื้นฐาน:

โปรตีนมีอยู่ในส่วนผสมที่ยุ่งเหยิงในเนื้อเยื่อหรือเซลล์ และเซลล์แต่ละประเภทประกอบด้วยโปรตีนที่แตกต่างกันหลายพันชนิด ดังนั้นความแตกต่างระหว่างโปรตีนจึงเป็นส่วนสำคัญของชีวเคมี และไม่ได้อยู่คนเดียว หรือชุดวิธีสำเร็จรูปสามารถกำจัดโปรตีนชนิดใดก็ได้ออกจากโปรตีนผสมที่ยุ่งเหยิงจึงมักใช้หลายวิธีร่วมกัน