คำถามที่พบบ่อยเกี่ยวกับ PCR 1. ผลลบลวง ไม่มีแถบขยายสัญญาณปรากฏขึ้น 2. ผลบวกลวง 3. มีแถบขยายสัญญาณที่ไม่เฉพาะเจาะจงปรากฏขึ้น 4. มีแถบลากหรือแถบสเมียร์ที่ไม่สม่ำเสมอ：

1ผลลบลวง ไม่มีแถบขยายปรากฏ ลักษณะสำคัญของปฏิกิริยา PCR คือ

1 การเตรียมกรดนิวคลีอิกแม่แบบ

2 คุณภาพไพรเมอร์และความจำเพาะ

3 คุณภาพของเอนไซม์และ

④ สภาวะวงจร PCR หากต้องการทราบสาเหตุ ควรวิเคราะห์และวิจัยตามลิงก์ด้านบนด้วย

แม่แบบ:

1 เทมเพลตประกอบด้วยโปรตีนเจือปน

เทมเพลตประกอบด้วยสารยับยั้งเอนไซม์ Taq

3. โปรตีนในเทมเพลตจะไม่ถูกย่อยและกำจัดออก โดยเฉพาะฮิสโตนในโครโมโซม

④ สูญเสียมากเกินไปในระหว่างการสกัดและเตรียมเทมเพลต หรือสูดดมฟีนอล

⑤กรดนิวคลีอิกของแม่แบบไม่ได้ถูกทำให้เสียสภาพอย่างสมบูรณ์ เมื่อคุณภาพของเอนไซม์และไพรเมอร์ดี หากไม่มีแถบขยายสัญญาณ เป็นไปได้มากว่ามีสิ่งผิดปกติเกิดขึ้นกับกระบวนการย่อยของตัวอย่างหรือกระบวนการสกัดกรดนิวคลีอิกแม่แบบ ดังนั้นจึงต้องเตรียมสารละลายในการย่อยที่มีประสิทธิภาพและมีเสถียรภาพ และขั้นตอนควรได้รับการแก้ไขและไม่ควรเปลี่ยนแปลงตามต้องการ - การยับยั้งเอนไซม์: จำเป็นต้องเปลี่ยนเอนไซม์ใหม่ หรือใช้ทั้งเอนไซม์เก่าและใหม่พร้อมกันเพื่อวิเคราะห์ว่าผลลบลวงเกิดจากการสูญเสียหรือการทำงานของเอนไซม์ไม่เพียงพอ ควรสังเกตว่าบางครั้งเอนไซม์ Taq จะถูกลืม ไพรเมอร์: คุณภาพของไพรเมอร์ ความเข้มข้นของไพรเมอร์ และความเข้มข้นของไพรเมอร์ทั้งสองมีความสมมาตรหรือไม่นั้น เป็นสาเหตุทั่วไปของความล้มเหลวของ PCR หรือแถบการขยายที่ไม่น่าพอใจและการแพร่กระจายได้ง่าย มีปัญหากับคุณภาพของการสังเคราะห์ไพรเมอร์ในบางชุด ไพรเมอร์ตัวใดตัวหนึ่งมีความเข้มข้นสูงและอีกตัวมีความเข้มข้นต่ำ ส่งผลให้แอมพลิฟายเออร์แบบไม่สมมาตรมีประสิทธิภาพต่ำ

มาตรการรับมือคือ:

1) เลือกหน่วยการสังเคราะห์ไพรเมอร์ที่ดี

2) ความเข้มข้นของไพรเมอร์ไม่เพียงแต่ควรดูที่ค่า OD เท่านั้น แต่ยังต้องคำนึงถึงสารละลายสต็อกไพรเมอร์สำหรับ agarose gel electrophoresis ด้วย จะต้องมีแถบไพรเมอร์ และความสว่างของแถบไพรเมอร์ทั้งสองควรจะใกล้เคียงกัน ตัวอย่างเช่น ไพรเมอร์ตัวหนึ่งมีแถบและไพรเมอร์อีกตัวไม่มีแถบ สำหรับแถบ PCR อาจล้มเหลวในเวลานี้ และควรได้รับการแก้ไขโดยการเจรจากับหน่วยการสังเคราะห์ไพรเมอร์ หากไพรเมอร์ตัวหนึ่งมีความสว่างสูงและอีกตัวมีความสว่างต่ำ ให้ปรับความเข้มข้นให้สมดุลเมื่อเจือจางไพรเมอร์

3 ควรเก็บไพรเมอร์ไว้ในความเข้มข้นสูงและปริมาณน้อยเพื่อป้องกันการแช่แข็งและละลายซ้ำๆ หรือการเก็บรักษาระยะยาวในตู้เย็น ซึ่งอาจนำไปสู่การเสื่อมสภาพและการเสื่อมสภาพของไพรเมอร์

④การออกแบบไพรเมอร์ไม่สมเหตุสมผล เช่น ความยาวไพรเมอร์ไม่เพียงพอ มีการสร้างไดเมอร์ระหว่างไพรเมอร์ เป็นต้น ความเข้มข้นของ Mg2+: ความเข้มข้นของไอออน Mg2+ มีอิทธิพลอย่างมากต่อประสิทธิภาพการขยาย PCR หากความเข้มข้นสูงเกินไป อาจลดความจำเพาะของการขยาย PCR ได้ หากความเข้มข้นต่ำเกินไป จะส่งผลต่อผลผลิตของการขยาย PCR และยังทำให้การขยาย PCR ล้มเหลวโดยไม่ต้องขยายแถบความถี่ การเปลี่ยนแปลงปริมาตรของปฏิกิริยา: โดยปกติแล้วปริมาตรที่ใช้สำหรับการขยาย PCR คือ 20ul, 30ul และ 50ul หรือ 100ul ควรใช้ปริมาตรใดในการขยาย PCR ตามวัตถุประสงค์ที่แตกต่างกันของการวิจัยทางวิทยาศาสตร์และการทดสอบทางคลินิก หลังจากสร้างปริมาตรเล็กน้อย เช่น 20ul แล้วสร้างปริมาตรมากขึ้น คุณต้องปฏิบัติตามเงื่อนไข ไม่เช่นนั้นจะล้มเหลวได้ง่าย เหตุผลทางกายภาพ: การสูญเสียสภาพธรรมชาติมีความสำคัญมากสำหรับการขยาย PCR ถ้าอุณหภูมิของการสูญเสียสภาพธรรมชาติต่ำและเวลาของการสูญเสียสภาพธรรมชาตินั้นสั้น ผลลบลวงก็มีแนวโน้มที่จะเกิดขึ้นอย่างมาก อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป ซึ่งอาจทำให้เกิดการขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจง และลดประสิทธิภาพการขยายเฉพาะ อุณหภูมิการหลอมสูงเกินไป มีผลอย่างมากต่อการเชื่อมโยงไพรเมอร์กับเทมเพลต และลดประสิทธิภาพการขยาย PCR บางครั้งจำเป็นต้องใช้เทอร์โมมิเตอร์มาตรฐานเพื่อตรวจสอบอุณหภูมิการเสียสภาพ การหลอม และการยืดออกในแอมพลิฟายเออร์หรือหม้อที่ละลายน้ำได้ นี่เป็นหนึ่งในสาเหตุของความล้มเหลวของ PCR การเปลี่ยนแปลงลำดับเป้าหมาย: หากลำดับเป้าหมายถูกกลายพันธุ์หรือถูกลบ ซึ่งส่งผลต่อการเชื่อมโยงไพรเมอร์กับเทมเพลตโดยเฉพาะ หรือไพรเมอร์และเทมเพลตสูญเสียลำดับเสริมเนื่องจากการลบส่วนใดส่วนหนึ่งของลำดับเป้าหมาย การขยาย PCR จะไม่ประสบความสำเร็จ

2.ผลบวกปลอม แถบขยาย PCR ที่ปรากฏนั้นสอดคล้องกับแถบลำดับเป้าหมาย และบางครั้งวงดนตรีก็เป็นระเบียบและสว่างกว่า การออกแบบไพรเมอร์ที่ไม่เหมาะสม: ลำดับการขยายที่เลือกมีความคล้ายคลึงกับลำดับการขยายที่ไม่ใช่เป้าหมาย ดังนั้น เมื่อดำเนินการขยาย PCR ผลิตภัณฑ์ PCR ที่ถูกขยายจะเป็นลำดับที่ไม่ใช่เป้าหมาย หากลำดับเป้าหมายสั้นเกินไปหรือไพรเมอร์สั้นเกินไป ผลบวกลวงอาจเกิดขึ้นได้ง่าย ไพรเมอร์จำเป็นต้องได้รับการออกแบบใหม่ การปนเปื้อนข้ามของลำดับเป้าหมายหรือผลิตภัณฑ์ขยายสัญญาณ: มีเหตุผลสองประการสำหรับการปนเปื้อนนี้: ประการแรก การปนเปื้อนข้ามของจีโนมทั้งหมดหรือชิ้นส่วนขนาดใหญ่ ซึ่งนำไปสู่ผลบวกลวง ผลบวกลวงนี้สามารถแก้ไขได้ด้วยวิธีการต่อไปนี้: ระมัดระวังและอ่อนโยนเมื่อใช้งานเพื่อป้องกันไม่ให้ลำดับเป้าหมายถูกดูดเข้าไปในปืนเก็บตัวอย่างหรือกระเด็นออกจากหลอดหมุนเหวี่ยง ยกเว้นเอนไซม์และสารที่ไม่สามารถทนต่ออุณหภูมิสูงได้ รีเอเจนต์หรืออุปกรณ์ทั้งหมดควรผ่านการฆ่าเชื้อด้วยแรงดันสูง หลอดสำหรับการหมุนเหวี่ยงและปิเปตสำหรับการฉีดตัวอย่างทั้งหมดควรใช้เพียงครั้งเดียว หากจำเป็น หลอดปฏิกิริยาและรีเอเจนต์จะถูกฉายรังสีด้วยแสงอัลตราไวโอเลตก่อนเติมตัวอย่างเพื่อทำลายกรดนิวคลีอิกที่มีอยู่ ประการที่สองคือการปนเปื้อนของกรดนิวคลีอิกชิ้นเล็ก ๆ ในอากาศ ชิ้นส่วนเล็กๆ เหล่านี้สั้นกว่าลำดับเป้าหมาย แต่มีความคล้ายคลึงกันบางอย่าง สามารถต่อเข้าด้วยกันได้ และหลังจากเสริมเข้ากับไพรเมอร์แล้ว ผลิตภัณฑ์ PCR ก็สามารถขยายได้ ซึ่งส่งผลให้เกิดผลบวกลวง ซึ่งสามารถลดหรือกำจัดได้โดยวิธี PCR แบบซ้อน

 

3.แถบขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจงปรากฏขึ้น แถบที่ปรากฏหลังจากการขยาย PCR ไม่สอดคล้องกับขนาดที่คาดไว้ ไม่ว่าจะใหญ่กว่าหรือเล็กกว่า หรือทั้งแถบขยายเฉพาะและแถบขยายแบบไม่เฉพาะเจาะจงปรากฏขึ้นพร้อมกัน สาเหตุของการปรากฏตัวของแถบที่ไม่เฉพาะเจาะจงคือ ประการแรก ไพรเมอร์ไม่ได้เสริมลำดับเป้าหมายอย่างสมบูรณ์ หรือไพรเมอร์รวมตัวกันเพื่อสร้างไดเมอร์ เหตุผลที่สองคือความเข้มข้นของไอออน Mg2+ สูงเกินไป อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป และจำนวนรอบ PCR สูงเกินไป ปัจจัยที่สองคือคุณภาพและปริมาณของเอนไซม์ เอนไซม์จากแหล่งบางแห่งมักมีแนวโน้มที่จะเกิดแถบที่ไม่เฉพาะเจาะจง แต่เอนไซม์จากแหล่งอื่นไม่เป็นเช่นนั้น บางครั้งปริมาณเอนไซม์ที่มากเกินไปอาจนำไปสู่การขยายที่ไม่เฉพาะเจาะจงได้ มาตรการรับมือได้แก่: ออกแบบไพรเมอร์ใหม่หากจำเป็น ลดปริมาณเอนไซม์หรือแทนที่ด้วยแหล่งอื่น ลดปริมาณไพรเมอร์ เพิ่มจำนวนเทมเพลตอย่างเหมาะสม และลดจำนวนรอบ เพิ่มอุณหภูมิการอบอ่อนอย่างเหมาะสม หรือใช้วิธีจุดสองอุณหภูมิ (การเสื่อมสภาพที่ 93°C การอบอ่อนและการขยายประมาณ 65°C)

 

4.การลากหรือรอยเปื้อนเป็นขุยปรากฏ การขยาย PCR บางครั้งปรากฏเป็นแถบเปื้อน แถบคล้ายแผ่น หรือแถบคล้ายพรม สาเหตุมักเกิดจากเอนไซม์มากเกินไปหรือคุณภาพของเอนไซม์ไม่ดี ความเข้มข้น dNTP สูงเกินไป ความเข้มข้น Mg2+ สูงเกินไป อุณหภูมิการหลอมต่ำเกินไป และรอบมากเกินไป มาตรการรับมือได้แก่: 1. ลดปริมาณของเอนไซม์หรือแทนที่เอนไซม์ด้วยแหล่งอื่น ②ลดความเข้มข้นของ dNTP ลดความเข้มข้นของ Mg2+ อย่างเหมาะสม เพิ่มจำนวนเทมเพลตและลดจำนวนรอบ