Саволҳои зуд-зуд ба PCR 1. Манфии бардурӯғ, банди пурқувваткунӣ пайдо намешавад 2. Мусбатии бардурӯғ 3. Лантаҳои ғайримуқаррарӣ пайдо мешаванд 4. Тасмаҳои кашолакунӣ ё тасмаҳои пошхӯрӣ пайдо мешаванд:

1Манфии бардурӯғ, банди пурқувватшуда пайдо намешавад. Ҷанбаҳои асосии реаксияи PCR инҳоянд

① тайёр кардани кислотаи нуклеинӣ шаблон

② сифат ва хусусияти ибтидоӣ

③ сифати фермент ва

④ Шароитҳои давраи PCR. Барои дарёфти сабабҳо низ бояд дар истиноди боло таҳлилу таҳқиқот гузаронида шавад.

Шаблон:

① Шаблон дорои сафедаҳои наҷосат аст

② Шаблон дорои ингибиторҳои ферментҳои Taq мебошад

③ Протеинҳо дар қолаб ҳазм намешаванд ва хориҷ карда намешаванд, махсусан гистонҳо дар хромосомаҳо

④ Ҳангоми истихроҷ ва тайёр кардани қолаб миқдори аз ҳад зиёд талаф шудааст ё фенол нафас гирифта шудааст

⑤ Шаблон кислотаи нуклеинӣ пурра денатуратсия нашудааст. Вақте ки сифати ферментҳо ва праймерҳо хуб аст, агар бандҳои амплификация пайдо нашаванд, эҳтимол дорад, ки дар раванди ҳозимаи намуна ё раванди истихроҷи кислотаи нуклеинӣ шаблон ягон хатогӣ вуҷуд дорад. Аз ин рӯ, бояд маҳлули муассир ва устувори ҳозима омода карда шавад ва тартиби муқаррар карда шавад ва набояд бо хоҳиши худ тағир дода шавад. . Бекор кардани фермент: иваз кардани ферментҳои нав ё ҳамзамон истифода бурдани ферментҳои кӯҳна ва нав лозим аст, то таҳлили манфиҳои бардурӯғ аз талафот ё фаъолияти нокифояи фермент ба вуҷуд омадааст. Бояд қайд кард, ки баъзан ферментҳои Taq фаромӯш мешаванд. Примерҳо: Сифати ибтидоӣ, консентратсияи праймер ва симметрӣ будани консентратсияи ду праймер сабабҳои маъмули нокомии ПТР ё бандҳои ғайриқаноатбахши тақвият ва паҳншавии осон мебошанд. Дар баъзе партияхо бо сифати синтези праймерхо проблемахо мавчуданд. Яке аз ду праймер консентратсияи баланд ва дигаре консентратсияи паст дорад, ки дар натиҷа амплификацияи асимметрии камсамар ба амал меояд.

Чораҳои муқобил инҳоянд:

① Як воҳиди хуби синтези праймерро интихоб кунед.

② Консентратсияи праймерҳо бояд на танҳо ба арзиши OD нигоҳ кунанд, балки инчунин ба маҳлули захираи праймер барои электрофорези гели агароз таваҷҷӯҳ зоҳир кунанд. Бояд бандҳои праймер вуҷуд дошта бошанд ва равшании ду бандҳои ибтидоӣ бояд тақрибан якхела бошанд. Масалан, як праймер банд дорад ва дигар праймер банд надорад. Барои тасмаҳо, PCR метавонад дар айни замон ноком шавад ва бояд тавассути гуфтушунид бо воҳиди синтези праймер ҳал карда шавад. Агар як праймер равшании баланд дошта бошад ва дигаре равшании паст дошта бошад, консентратсияҳоро ҳангоми ҳал кардани праймерҳо мувозинат кунед.

③ Примерҳо бояд дар консентратсияи баланд ва миқдори кам нигоҳ дошта шаванд, то яхкунӣ ва обшавии такрорӣ ё нигоҳдории дарозмуддат дар яхдон, ки метавонад ба бадшавӣ ва таназзули праймерҳо оварда расонад.

④Тарҳрезии праймер беасос аст, ба монанди дарозии праймер кофӣ нест, димерҳо дар байни праймерҳо пайдо мешаванд ва ғайра. Консентратсияи Mg2+: Консентратсияи ионҳои Mg2+ ба самаранокии пурқувваткунии PCR таъсири калон мерасонад. Агар консентратсияи хеле баланд бошад, он метавонад хусусияти амплификацияи PCR-ро коҳиш диҳад. Агар консентратсияи он хеле паст бошад, он ба ҳосилнокии пурзӯркунии PCR таъсир мерасонад ва ҳатто боиси нокомии пурзӯркунии PCR бе бандҳои пурқувват мегардад. Тағйирот дар ҳаҷми реаксия: Одатан ҳаҷмҳое, ки барои тақвияти PCR истифода мешаванд, 20ul, 30ul ва 50ul мебошанд. Ё 100ul, кадом ҳаҷм бояд барои тақвияти PCR истифода шавад, мувофиқи мақсадҳои гуногуни тадқиқоти илмӣ ва санҷиши клиникӣ муқаррар карда мешавад. Пас аз сохтани ҳаҷми хурд, ба монанди 20ul, ва сипас сохтани ҳаҷми калонтар, шумо бояд шартҳоро риоя кунед, вагарна он ба осонӣ ноком мешавад. Сабабҳои физикӣ: Денатуратсия барои тақвияти PCR хеле муҳим аст. Агар ҳарорати денатуратсия паст бошад ва вақти денатуратсия кӯтоҳ бошад, эҳтимоли манфии бардурӯғ пайдо мешавад; ҳарорати гармкунӣ хеле паст аст, ки ин метавонад боиси тақвияти ғайримуқаррарӣ гардад ва самаранокии мушаххаси тақвиятро коҳиш диҳад. Ҳарорати гармкунӣ хеле баланд аст. Ба пайвастшавии праймерҳо ба қолибҳо таъсири зиёд мерасонад ва самаранокии пурқувваткунии PCR-ро коҳиш медиҳад. Баъзан лозим меояд, ки ҳароратсанҷи стандартиро барои санҷидани ҳарорати денатуратсия, гармкунӣ ва дарозкунӣ дар пурқувваткунанда ё деги дар об ҳалшаванда истифода бурд. Ин ҳам яке аз сабабҳои нокомии PCR мебошад. Тағйирёбии пайдарпаии ҳадаф: Агар пайдарпаии ҳадаф мутатсия ё нест карда шавад, ки ба пайвастшавии мушаххаси праймер ба қолаб таъсир расонад ё праймер ва қолаб бо сабаби нест кардани сегменти муайяни пайдарпаии мақсаднок пайдарпайии иловагиро аз даст медиҳанд, тақвияти PCR муваффақ нахоҳад шуд.

2.бардурӯғ мусбӣ Банди тақвияти PCR, ки пайдо мешавад, бо банди пайдарпайии ҳадаф мувофиқ аст ва баъзан банд бо тартиб ва равшантар аст. Тарҳрезии праймери номувофиқ: пайдарпаии амплификацияи интихобшуда бо пайдарпаии амплификацияи ғайриҳадаф якхела дорад, аз ин рӯ ҳангоми иҷрои пурзӯркунии PCR, маҳсулоти пурқувватшудаи ПЗР пайдарпаии ғайриҳадаф аст. Агар пайдарпаии мақсаднок хеле кӯтоҳ бошад ё праймер хеле кӯтоҳ бошад, ба осонӣ мусбатҳои бардурӯғ пайдо мешаванд. Примерҳоро аз нав тарҳрезӣ кардан лозим аст. Ифлосшавии байниҳамдигарии пайдарпаии мақсаднок ё маҳсулоти амплификация: Ду сабаб барои ин ифлосшавӣ вуҷуд дорад: Якум, ифлосшавии байниҳамдигарии тамоми геном ё порчаҳои калон, ки боиси мусбатҳои бардурӯғ мегардад. Ин мусбати бардурӯғро бо усулҳои зерин ҳал кардан мумкин аст: Ҳангоми кор кардан бодиққат ва нарм бошед, то пайдарпаии мақсаднок ба таппончаи намуна ғарқ нашавад ё аз найчаи центрифуга пошида нашавад. Ба гайр аз ферментхо ва моддахое, ки ба харорати баланд тоб оварда наметавонанд, хамаи реактивхо ва тачхизот бояд бо фишори баланд стерилизатсия карда шаванд. Ҳама найҳои центрифуга ва нӯги пипеткаҳои тазриқӣ бояд як маротиба истифода шаванд. Дар ҳолати зарурӣ, найҳои реаксия ва реактивҳо пеш аз илова кардани намуна бо нури ултрабунафш шуоъ карда мешаванд, то ки кислотаҳои нуклеини мавҷударо нест кунанд. Дуюм ифлосшавии порчаҳои хурди кислотаҳои нуклеинӣ дар ҳаво мебошад. Ин порчаҳои хурд аз пайдарпаии мақсаднок кӯтоҳтаранд, аммо гомологияи муайян доранд. Онҳоро метавон ба ҳамдигар пайваст кард ва пас аз илова кардани праймерҳо, маҳсулоти ПТР метавонад афзоиш ёбад, ки дар натиҷа мусбатҳои бардурӯғ ба вуҷуд меоянд, ки онҳоро бо усулҳои лонашудаи PCR коҳиш додан ё нест кардан мумкин аст.

 

3.Бандҳои амплификатсияи ғайримахсус пайдо мешаванд Бастаҳое, ки пас аз пурзӯркунии PCR пайдо мешаванд, ба андозаи пешбинишуда мувофиқат намекунанд, ё калонтар ё хурдтар, ё ҳарду бандҳои мушаххаси тақвиятдиҳӣ ва бандҳои ғайримахсуси тақвият дар як вақт пайдо мешаванд. Сабабҳои пайдоиши бандҳои ғайримуқаррарӣ инҳоянд: якум, праймерҳо ба пайдарпаии мақсаднок пурра мувофиқ нестанд ё праймерҳо ҷамъ шуда, димерҳоро ташкил медиҳанд. Сабаби дуюм ин аст, ки консентратсияи ионҳои Mg2+ хеле баланд аст, ҳарорати гармкунӣ хеле паст аст ва шумораи давраҳои PCR хеле зиёд аст. Омили дуюм сифат ва миқдори фермент мебошад. Ферментҳои баъзе манбаъҳо аксар вақт ба бандҳои ғайримуқаррарӣ майл доранд, аммо ферментҳои дигар манбаъҳо ин тавр нестанд. Миқдори аз ҳад зиёди ферментҳо баъзан метавонад ба амплификацияи ғайримуқаррарӣ оварда расонад. Чораҳои муқобил иборатанд аз: агар лозим бошад, тарҳрезии праймерҳо. Миқдори ферментро кам кунед ё онро бо манбаи дигар иваз кунед. Миқдори праймерҳоро кам кунед, миқдори қолабро ба таври мувофиқ зиёд кунед ва шумораи давраҳоро кам кунед. Ҳарорати гармкуниро ба таври мувофиқ баланд кунед ё усули нуқтаи дуҳароратро истифода баред (денатуратсия дар 93 ° C, гармкунӣ ва дарозкунӣ тақрибан 65 ° C).

 

4.Кашолакунӣ ё бӯйҳои пошхӯрда пайдо мешаванд Амплификатсияи ПТР баъзан ҳамчун бандҳои пошида, бандҳои варақ монанд ё бандҳои қолин монанд пайдо мешаванд. Сабабҳо аксар вақт аз ҳад зиёд фермент ё сифати пасти фермент, консентратсияи аз ҳад зиёди dNTP, консентратсияи аз ҳад зиёди Mg2 +, ҳарорати аз ҳад пасти табобат ва давраҳои аз ҳад зиёд ба вуҷуд меоянд. Чораҳои муқобил иборатанд аз: ① Коҳиш додани миқдори фермент ё иваз кардани фермент бо манбаи дигар. ②Коҳиш додани консентратсияи dNTP. Консентратсияи Mg2+-ро дуруст кам кунед. Миқдори қолибҳоро зиёд кунед ва шумораи давраҳоро кам кунед