PCR FAQ 1. ఫాల్స్ నెగటివ్, యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్ కనిపించదు 2. ఫాల్స్ పాజిటివ్ 3. నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు కనిపిస్తాయి 4. ఫ్లాకీ డ్రాగ్ స్ట్రిప్స్ లేదా స్మెర్ స్ట్రిప్స్ కనిపిస్తాయి:

1తప్పుడు ప్రతికూలత, విస్తరించిన బ్యాండ్ కనిపించదు PCR ప్రతిచర్య యొక్క ముఖ్య అంశాలు

① టెంప్లేట్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ తయారీ

② ప్రైమర్ నాణ్యత మరియు విశిష్టత

③ ఎంజైమ్ నాణ్యత మరియు

④ PCR చక్రం పరిస్థితులు. కారణాలను కనుగొనడానికి, పై లింక్‌లపై విశ్లేషణ మరియు పరిశోధన కూడా నిర్వహించాలి.

టెంప్లేట్:

① టెంప్లేట్ అశుద్ధ ప్రోటీన్లను కలిగి ఉంది

② టెంప్లేట్ Taq ఎంజైమ్ ఇన్హిబిటర్లను కలిగి ఉంది

③ టెంప్లేట్‌లోని ప్రోటీన్లు జీర్ణం కావు మరియు తీసివేయబడవు, ముఖ్యంగా క్రోమోజోమ్‌లలోని హిస్టోన్‌లు

④ టెంప్లేట్ యొక్క వెలికితీత మరియు తయారీ సమయంలో చాలా ఎక్కువ పోయింది లేదా ఫినాల్ పీల్చబడుతుంది

⑤న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ టెంప్లేట్ పూర్తిగా డీనాట్ చేయబడలేదు. ఎంజైమ్‌లు మరియు ప్రైమర్‌ల నాణ్యత బాగున్నప్పుడు, యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు కనిపించకపోతే, నమూనా యొక్క జీర్ణక్రియ ప్రక్రియలో లేదా టెంప్లేట్ న్యూక్లియిక్ యాసిడ్ వెలికితీత ప్రక్రియలో ఏదో లోపం ఉండవచ్చు. అందువల్ల, సమర్థవంతమైన మరియు స్థిరమైన జీర్ణక్రియ పరిష్కారాన్ని సిద్ధం చేయాలి మరియు ప్రక్రియను పరిష్కరించాలి మరియు ఇష్టానుసారం మార్చకూడదు. . ఎంజైమ్ క్రియారహితం: కొత్త ఎంజైమ్‌ను భర్తీ చేయడం లేదా పాత మరియు కొత్త ఎంజైమ్‌లను ఒకే సమయంలో ఉపయోగించడం అవసరం, తప్పుడు ప్రతికూలతలు నష్టం లేదా తగినంత ఎంజైమ్ కార్యకలాపాలు కారణంగా ఉన్నాయా అని విశ్లేషించడానికి. కొన్నిసార్లు Taq ఎంజైమ్‌ను మర్చిపోతారని గమనించాలి.ప్రైమర్‌లు: ప్రైమర్ నాణ్యత, ప్రైమర్ ఏకాగ్రత, మరియు రెండు ప్రైమర్‌ల సాంద్రతలు సుష్టంగా ఉన్నాయా లేదా అనేది PCR వైఫల్యం లేదా సంతృప్తికరంగా లేని యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు మరియు సులభంగా వ్యాప్తి చెందడానికి సాధారణ కారణాలు. కొన్ని బ్యాచ్‌లలో ప్రైమర్ సింథసిస్ నాణ్యతతో సమస్యలు ఉన్నాయి. రెండు ప్రైమర్‌లలో ఒకటి అధిక సాంద్రతను కలిగి ఉంటుంది మరియు మరొకటి తక్కువ గాఢతను కలిగి ఉంటుంది, ఫలితంగా తక్కువ సామర్థ్యం గల అసమాన విస్తరణ జరుగుతుంది.

వ్యతిరేక చర్యలు:

① మంచి ప్రైమర్ సింథసిస్ యూనిట్‌ని ఎంచుకోండి.

② ప్రైమర్‌ల ఏకాగ్రత OD విలువను మాత్రమే కాకుండా, అగరోజ్ జెల్ ఎలెక్ట్రోఫోరేసిస్ కోసం ప్రైమర్ స్టాక్ సొల్యూషన్‌పై కూడా దృష్టి పెట్టాలి. తప్పనిసరిగా ప్రైమర్ బ్యాండ్‌లు ఉండాలి మరియు రెండు ప్రైమర్ బ్యాండ్‌ల ప్రకాశం దాదాపు ఒకే విధంగా ఉండాలి. ఉదాహరణకు, ఒక ప్రైమర్‌కు బ్యాండ్ ఉంటుంది మరియు మరొక ప్రైమర్‌కు బ్యాండ్ లేదు. స్ట్రిప్స్ కోసం, PCR ఈ సమయంలో విఫలం కావచ్చు మరియు ప్రైమర్ సింథసిస్ యూనిట్‌తో చర్చల ద్వారా పరిష్కరించబడాలి. ఒక ప్రైమర్‌కు ఎక్కువ ప్రకాశం ఉంటే మరియు మరొకటి తక్కువ ప్రకాశం కలిగి ఉంటే, ప్రైమర్‌లను పలుచన చేసేటప్పుడు సాంద్రతలను సమతుల్యం చేయండి.

③ ప్రైమర్‌లను రిఫ్రిజిరేటర్‌లో పదేపదే గడ్డకట్టడం మరియు కరిగించడం లేదా దీర్ఘకాలిక నిల్వను నిరోధించడానికి అధిక సాంద్రత మరియు తక్కువ పరిమాణంలో నిల్వ చేయాలి, ఇది ప్రైమర్‌ల క్షీణత మరియు క్షీణతకు దారితీయవచ్చు.

④ ప్రైమర్ డిజైన్ అసమంజసమైనది, ప్రైమర్ పొడవు సరిపోదు, ప్రైమర్‌ల మధ్య డైమర్‌లు ఏర్పడతాయి మొదలైనవి. Mg2+ ఏకాగ్రత: Mg2+ అయాన్ గాఢత PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యంపై గొప్ప ప్రభావాన్ని చూపుతుంది. ఏకాగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంటే, అది PCR యాంప్లిఫికేషన్ యొక్క నిర్దిష్టతను తగ్గిస్తుంది. ఏకాగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంటే, అది PCR యాంప్లిఫికేషన్ దిగుబడిని ప్రభావితం చేస్తుంది మరియు బ్యాండ్‌లను విస్తరించకుండా PCR యాంప్లిఫికేషన్ విఫలమయ్యేలా చేస్తుంది. ప్రతిచర్య వాల్యూమ్‌లో మార్పులు: సాధారణంగా PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఉపయోగించే వాల్యూమ్‌లు 20ul, 30ul మరియు 50ul. లేదా 100ul, PCR యాంప్లిఫికేషన్ కోసం ఏ వాల్యూమ్ ఉపయోగించాలి అనేది శాస్త్రీయ పరిశోధన మరియు క్లినికల్ టెస్టింగ్ యొక్క విభిన్న ప్రయోజనాల ప్రకారం సెట్ చేయబడింది. 20ul వంటి చిన్న వాల్యూమ్‌ను తయారు చేసి, ఆపై పెద్ద వాల్యూమ్‌ను చేసిన తర్వాత, మీరు తప్పనిసరిగా షరతులను అనుసరించాలి, లేకుంటే అది సులభంగా విఫలమవుతుంది. భౌతిక కారణాలు: PCR విస్తరణకు డీనాటరేషన్ చాలా ముఖ్యమైనది. డీనాటరేషన్ ఉష్ణోగ్రత తక్కువగా ఉంటే మరియు డీనాటరేషన్ సమయం తక్కువగా ఉంటే, తప్పుడు ప్రతికూలతలు సంభవించే అవకాశం ఉంది; ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంది, ఇది నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు కారణమవుతుంది మరియు నిర్దిష్ట యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది. ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా ఎక్కువగా ఉంది. టెంప్లేట్‌లకు ప్రైమర్‌ల బైండింగ్‌ను బాగా ప్రభావితం చేస్తుంది మరియు PCR యాంప్లిఫికేషన్ సామర్థ్యాన్ని తగ్గిస్తుంది. కొన్నిసార్లు యాంప్లిఫైయర్ లేదా నీటిలో కరిగే కుండలో డీనాటరేషన్, ఎనియలింగ్ మరియు ఎక్స్‌టెన్షన్ ఉష్ణోగ్రతలను తనిఖీ చేయడానికి ప్రామాణిక థర్మామీటర్‌ను ఉపయోగించడం అవసరం. PCR వైఫల్యానికి ఇది కూడా ఒక కారణం. లక్ష్య శ్రేణి వైవిధ్యం: లక్ష్య క్రమాన్ని మార్చినట్లయితే లేదా తొలగించబడితే, ఇది టెంప్లేట్‌కు ప్రైమర్ యొక్క నిర్దిష్ట బైండింగ్‌ను ప్రభావితం చేస్తే లేదా లక్ష్య శ్రేణిలోని నిర్దిష్ట విభాగాన్ని తొలగించడం వలన ప్రైమర్ మరియు టెంప్లేట్ పరిపూరకరమైన క్రమాన్ని కోల్పోతే, PCR విస్తరణ విజయం సాధించదు.

2.false పాజిటివ్ కనిపించే PCR యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్ టార్గెట్ సీక్వెన్స్ బ్యాండ్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది మరియు కొన్నిసార్లు బ్యాండ్ మరింత క్రమబద్ధంగా మరియు ప్రకాశవంతంగా ఉంటుంది. తగని ప్రైమర్ డిజైన్: ఎంచుకున్న యాంప్లిఫికేషన్ సీక్వెన్స్ నాన్-టార్గెట్ యాంప్లిఫికేషన్ సీక్వెన్స్‌తో హోమోలజీని కలిగి ఉంటుంది, కాబట్టి PCR యాంప్లిఫికేషన్ చేస్తున్నప్పుడు, యాంప్లిఫైడ్ PCR ఉత్పత్తి లక్ష్యం కాని క్రమం. లక్ష్య క్రమం చాలా తక్కువగా ఉంటే లేదా ప్రైమర్ చాలా తక్కువగా ఉంటే, తప్పుడు పాజిటివ్‌లు సులభంగా సంభవించవచ్చు. ప్రైమర్‌లను రీడిజైన్ చేయాలి. లక్ష్య క్రమాలు లేదా యాంప్లిఫికేషన్ ఉత్పత్తుల యొక్క క్రాస్-కాలుష్యం: ఈ కాలుష్యానికి రెండు కారణాలు ఉన్నాయి: మొదటిది, మొత్తం జన్యువు లేదా పెద్ద శకలాలు క్రాస్-కాలుష్యం, తప్పుడు పాజిటివ్‌లకు దారి తీస్తుంది. ఈ తప్పుడు సానుకూలతను క్రింది పద్ధతుల ద్వారా పరిష్కరించవచ్చు: లక్ష్య క్రమాన్ని నమూనా తుపాకీలోకి పీల్చుకోకుండా లేదా సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్ నుండి స్ప్లాష్ చేయకుండా ఆపరేట్ చేసేటప్పుడు జాగ్రత్తగా మరియు సున్నితంగా ఉండండి. అధిక ఉష్ణోగ్రతలను తట్టుకోలేని ఎంజైమ్‌లు మరియు పదార్థాలు మినహా, అన్ని కారకాలు లేదా పరికరాలను అధిక పీడనం ద్వారా క్రిమిరహితం చేయాలి. అన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్‌లు మరియు నమూనా ఇంజెక్షన్ పైపెట్ చిట్కాలను ఒకసారి ఉపయోగించాలి. అవసరమైతే, ప్రస్తుతం ఉన్న న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాలను నాశనం చేయడానికి నమూనాను జోడించే ముందు ప్రతిచర్య గొట్టాలు మరియు కారకాలు అతినీలలోహిత కాంతితో వికిరణం చేయబడతాయి. రెండవది గాలిలో న్యూక్లియిక్ ఆమ్లాల చిన్న శకలాలు కలుషితం. ఈ చిన్న శకలాలు లక్ష్య శ్రేణి కంటే తక్కువగా ఉంటాయి, కానీ నిర్దిష్ట హోమోలజీని కలిగి ఉంటాయి. అవి ఒకదానికొకటి విభజించబడతాయి మరియు ప్రైమర్‌లకు అనుబంధంగా ఉన్న తర్వాత, PCR ఉత్పత్తులను విస్తరించవచ్చు, ఫలితంగా తప్పుడు పాజిటివ్‌లు ఉంటాయి, వీటిని సమూహ PCR పద్ధతుల ద్వారా తగ్గించవచ్చు లేదా తొలగించవచ్చు.

 

3.నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు కనిపిస్తాయి PCR యాంప్లిఫికేషన్ తర్వాత కనిపించే బ్యాండ్‌లు పెద్దవి లేదా చిన్నవిగా ఊహించిన పరిమాణానికి విరుద్ధంగా ఉంటాయి లేదా నిర్దిష్ట యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు మరియు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్ బ్యాండ్‌లు రెండూ ఒకే సమయంలో కనిపిస్తాయి. నాన్-స్పెసిఫిక్ బ్యాండ్‌లు కనిపించడానికి గల కారణాలు: ముందుగా, ప్రైమర్‌లు లక్ష్య క్రమానికి పూర్తిగా పరిపూరకరమైనవి కావు లేదా ప్రైమర్‌లు డైమర్‌లను ఏర్పరుస్తాయి. రెండవ కారణం ఏమిటంటే, Mg2+ అయాన్ గాఢత చాలా ఎక్కువగా ఉంది, ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత చాలా తక్కువగా ఉంది మరియు PCR చక్రాల సంఖ్య చాలా ఎక్కువగా ఉంది. రెండవ అంశం ఎంజైమ్ యొక్క నాణ్యత మరియు పరిమాణం. కొన్ని మూలాల నుండి ఎంజైమ్‌లు తరచుగా నిర్దిష్ట-కాని బ్యాండ్‌లకు గురవుతాయి కానీ ఇతర మూలాల నుండి ఎంజైమ్‌లు అలా చేయవు. అధిక మొత్తంలో ఎంజైమ్‌లు కొన్నిసార్లు నాన్-స్పెసిఫిక్ యాంప్లిఫికేషన్‌కు దారితీయవచ్చు. ప్రతిఘటనలలో ఇవి ఉన్నాయి: అవసరమైతే ప్రైమర్‌లను రీడిజైన్ చేయండి. ఎంజైమ్ మొత్తాన్ని తగ్గించండి లేదా మరొక మూలంతో భర్తీ చేయండి. ప్రైమర్‌ల మొత్తాన్ని తగ్గించండి, టెంప్లేట్ మొత్తాన్ని తగిన విధంగా పెంచండి మరియు చక్రాల సంఖ్యను తగ్గించండి. ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రతను తగిన విధంగా పెంచండి లేదా రెండు-ఉష్ణోగ్రత పాయింట్ పద్ధతిని ఉపయోగించండి (93°C వద్ద డీనాటరేషన్, 65°C చుట్టూ ఎనియలింగ్ మరియు పొడిగింపు).

 

4. ఫ్లాకీ డ్రాగ్ లేదా స్మెర్స్ కనిపిస్తాయి PCR యాంప్లిఫికేషన్ కొన్నిసార్లు స్మెర్డ్ బ్యాండ్‌లు, షీట్ లాంటి బ్యాండ్‌లు లేదా కార్పెట్ లాంటి బ్యాండ్‌లుగా కనిపిస్తుంది. చాలా ఎంజైమ్ లేదా ఎంజైమ్ నాణ్యత తక్కువగా ఉండటం, చాలా ఎక్కువ dNTP గాఢత, చాలా ఎక్కువ Mg2+ గాఢత, చాలా తక్కువ ఎనియలింగ్ ఉష్ణోగ్రత మరియు చాలా చక్రాల కారణంగా కారణాలు తరచుగా సంభవిస్తాయి. ప్రతిఘటనలలో ఇవి ఉన్నాయి: ① ఎంజైమ్ మొత్తాన్ని తగ్గించండి లేదా ఎంజైమ్‌ను మరొక మూలంతో భర్తీ చేయండి. ②dNTP గాఢతను తగ్గించండి. Mg2+ గాఢతను తగిన విధంగా తగ్గించండి. టెంప్లేట్‌ల మొత్తాన్ని పెంచండి మరియు చక్రాల సంఖ్యను తగ్గించండి