PCR அடிக்கடி கேட்கப்படும் கேள்விகள் 1. தவறான எதிர்மறை, எந்த பெருக்க பட்டையும் தோன்றவில்லை 2. தவறான நேர்மறை 3. குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்க பட்டைகள் தோன்றும் 4. ஃபிளாக்கி இழுவை பட்டைகள் அல்லது ஸ்மியர் பட்டைகள் தோன்றும்:

1 தவறான எதிர்மறை, பெரிதாக்கப்பட்ட இசைக்குழு தோன்றவில்லை PCR எதிர்வினையின் முக்கிய அம்சங்கள்

① வார்ப்புரு நியூக்ளிக் அமிலம் தயாரித்தல்

② முதன்மை தரம் மற்றும் தனித்தன்மை

③ என்சைம் தரம் மற்றும்

④ PCR சுழற்சி நிலைமைகள். காரணங்களைக் கண்டறிய, மேலே உள்ள இணைப்புகளில் பகுப்பாய்வு மற்றும் ஆராய்ச்சி நடத்தப்பட வேண்டும்.

டெம்ப்ளேட்:

① டெம்ப்ளேட்டில் தூய்மையற்ற புரதங்கள் உள்ளன

② டெம்ப்ளேட்டில் Taq என்சைம் தடுப்பான்கள் உள்ளன

③ டெம்ப்ளேட்டில் உள்ள புரதங்கள் செரிக்கப்படுவதில்லை மற்றும் அகற்றப்படுவதில்லை, குறிப்பாக குரோமோசோம்களில் உள்ள ஹிஸ்டோன்கள்

④ டெம்ப்ளேட்டை பிரித்தெடுத்தல் மற்றும் தயாரிப்பின் போது அதிகமாக இழந்தது அல்லது பீனால் உள்ளிழுக்கப்பட்டது

⑤நியூக்ளிக் அமிலம் என்ற டெம்ப்ளேட் முழுமையாகக் குறைக்கப்படவில்லை. என்சைம்கள் மற்றும் ப்ரைமர்களின் தரம் நன்றாக இருக்கும் போது, ​​பெருக்க பட்டைகள் தோன்றவில்லை என்றால், அது மாதிரியின் செரிமான செயல்முறை அல்லது டெம்ப்ளேட் நியூக்ளிக் அமிலம் பிரித்தெடுக்கும் செயல்பாட்டில் ஏதோ தவறு இருக்கலாம். எனவே, ஒரு பயனுள்ள மற்றும் நிலையான செரிமான தீர்வு தயாரிக்கப்பட வேண்டும், மேலும் செயல்முறை சரி செய்யப்பட வேண்டும் மற்றும் விருப்பப்படி மாற்றப்படக்கூடாது. . என்சைம் செயலிழக்கச் செய்தல்: புதிய நொதியை மாற்றுவது அவசியம், அல்லது பழைய மற்றும் புதிய நொதிகள் இரண்டையும் ஒரே நேரத்தில் பயன்படுத்தி தவறான எதிர்மறைகள் இழப்பு அல்லது போதுமான நொதி செயல்பாட்டினால் ஏற்படுகின்றனவா என்பதை ஆய்வு செய்ய வேண்டும். சில சமயங்களில் Taq நொதி மறந்துவிடுகிறது என்பதைக் கவனத்தில் கொள்ள வேண்டும். ப்ரைமர்கள்: ப்ரைமர் தரம், ப்ரைமர் செறிவு மற்றும் இரண்டு ப்ரைமர்களின் செறிவுகள் சமச்சீராக உள்ளதா என்பது PCR தோல்வி அல்லது திருப்தியற்ற பெருக்க பட்டைகள் மற்றும் எளிதான பரவலுக்கு பொதுவான காரணங்கள். சில தொகுதிகளில் ப்ரைமர் தொகுப்பின் தரத்தில் சிக்கல்கள் உள்ளன. இரண்டு ப்ரைமர்களில் ஒன்று அதிக செறிவு மற்றும் மற்றொன்று குறைந்த செறிவு கொண்டது, இதன் விளைவாக குறைந்த செயல்திறன் சமச்சீரற்ற பெருக்கம் ஏற்படுகிறது.

எதிர் நடவடிக்கைகள்:

① நல்ல ப்ரைமர் சின்தஸிஸ் யூனிட்டைத் தேர்ந்தெடுக்கவும்.

② ப்ரைமர்களின் செறிவு OD மதிப்பை மட்டும் பார்க்காமல், அகரோஸ் ஜெல் எலக்ட்ரோபோரேசிஸிற்கான ப்ரைமர் ஸ்டாக் கரைசலுக்கும் கவனம் செலுத்த வேண்டும். ப்ரைமர் பேண்டுகள் இருக்க வேண்டும், இரண்டு ப்ரைமர் பேண்டுகளின் பிரகாசம் தோராயமாக ஒரே மாதிரியாக இருக்க வேண்டும். எடுத்துக்காட்டாக, ஒரு ப்ரைமரில் பேண்ட் உள்ளது, மற்றொன்று ப்ரைமரில் பேண்ட் இல்லை. கீற்றுகளுக்கு, PCR இந்த நேரத்தில் தோல்வியடையும் மற்றும் ப்ரைமர் சின்தஸிஸ் யூனிட்டுடன் பேச்சுவார்த்தை மூலம் தீர்க்கப்பட வேண்டும். ஒரு ப்ரைமரில் அதிக பிரகாசமும் மற்றொன்று குறைந்த பிரகாசமும் இருந்தால், ப்ரைமர்களை நீர்த்துப்போகச் செய்யும் போது செறிவுகளை சமப்படுத்தவும்.

③ ப்ரைமர்கள் அதிக செறிவு மற்றும் சிறிய அளவுகளில் சேமிக்கப்பட வேண்டும், இது மீண்டும் மீண்டும் உறைதல் மற்றும் கரைதல் அல்லது குளிர்சாதன பெட்டியில் நீண்ட கால சேமிப்பை தடுக்கிறது, இது ப்ரைமர்களின் சிதைவு மற்றும் சிதைவுக்கு வழிவகுக்கும்.

④ ப்ரைமர் வடிவமைப்பு நியாயமற்றது, ப்ரைமர் நீளம் போதுமானதாக இல்லை, ப்ரைமர்களுக்கு இடையில் டைமர்கள் உருவாகின்றன, முதலியன. Mg2+ செறிவு: Mg2+ அயன் செறிவு PCR பெருக்க செயல்திறனில் பெரும் தாக்கத்தை ஏற்படுத்துகிறது. செறிவு மிக அதிகமாக இருந்தால், அது PCR பெருக்கத்தின் தனித்தன்மையைக் குறைக்கலாம். செறிவு மிகக் குறைவாக இருந்தால், அது PCR பெருக்க விளைச்சலைப் பாதிக்கும் மற்றும் பட்டைகளை பெருக்காமல் PCR பெருக்கத்தை தோல்வியடையச் செய்யும். எதிர்வினை அளவின் மாற்றங்கள்: பொதுவாக PCR பெருக்கத்திற்குப் பயன்படுத்தப்படும் தொகுதிகள் 20ul, 30ul மற்றும் 50ul ஆகும். அல்லது 100ul, PCR பெருக்கத்திற்கு எந்த அளவு பயன்படுத்த வேண்டும் என்பது அறிவியல் ஆராய்ச்சி மற்றும் மருத்துவ பரிசோதனையின் வெவ்வேறு நோக்கங்களின்படி அமைக்கப்படுகிறது. 20ul போன்ற சிறிய தொகுதியை உருவாக்கி, பின்னர் ஒரு பெரிய தொகுதியை உருவாக்கிய பிறகு, நீங்கள் நிபந்தனைகளைப் பின்பற்ற வேண்டும், இல்லையெனில் அது எளிதில் தோல்வியடையும். இயற்பியல் காரணங்கள்: பிசிஆர் பெருக்கத்திற்கு டினாட்டரேஷன் மிகவும் முக்கியமானது. denaturation வெப்பநிலை குறைவாக இருந்தால் மற்றும் denaturation நேரம் குறைவாக இருந்தால், தவறான எதிர்மறைகள் ஏற்பட வாய்ப்புகள் அதிகம்; அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது, இது குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்தை ஏற்படுத்தலாம் மற்றும் குறிப்பிட்ட பெருக்க செயல்திறனைக் குறைக்கலாம். அனீலிங் வெப்பநிலை மிக அதிகமாக உள்ளது. ப்ரைமர்களை டெம்ப்ளேட்களுடன் பிணைப்பதை மிகவும் பாதிக்கிறது மற்றும் PCR பெருக்க செயல்திறனைக் குறைக்கிறது. சில சமயங்களில் பெருக்கி அல்லது நீரில் கரையக்கூடிய பானையில் டினாட்டரேஷன், அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு வெப்பநிலையை சரிபார்க்க நிலையான தெர்மோமீட்டரைப் பயன்படுத்துவது அவசியம். PCR தோல்விக்கு இதுவும் ஒரு காரணம். இலக்கு வரிசை மாறுபாடு: இலக்கு வரிசை மாற்றப்பட்டால் அல்லது நீக்கப்பட்டால், இது ப்ரைமரின் குறிப்பிட்ட பிணைப்பை டெம்ப்ளேட்டுடன் பாதிக்கிறது, அல்லது ப்ரைமர் மற்றும் டெம்ப்ளேட் இலக்கு வரிசையின் ஒரு குறிப்பிட்ட பகுதியை நீக்குவதன் காரணமாக நிரப்பு வரிசையை இழந்தால், PCR பெருக்கம் வெற்றியடையாது.

2.false நேர்மறை தோன்றும் PCR பெருக்க இசைக்குழு இலக்கு வரிசை இசைக்குழுவுடன் ஒத்துப்போகிறது, மேலும் சில சமயங்களில் இசைக்குழு மிகவும் ஒழுங்காகவும் பிரகாசமாகவும் இருக்கும். பொருத்தமற்ற ப்ரைமர் வடிவமைப்பு: தேர்ந்தெடுக்கப்பட்ட பெருக்க வரிசையானது இலக்கு அல்லாத பெருக்க வரிசையுடன் ஹோமோலஜியைக் கொண்டுள்ளது, எனவே PCR பெருக்கத்தைச் செய்யும்போது, ​​பெருக்கப்பட்ட PCR தயாரிப்பு இலக்கு அல்லாத வரிசையாகும். இலக்கு வரிசை மிகவும் குறுகியதாக இருந்தால் அல்லது ப்ரைமர் மிகக் குறைவாக இருந்தால், தவறான நேர்மறைகள் எளிதில் ஏற்படலாம். ப்ரைமர்கள் மறுவடிவமைப்பு செய்யப்பட வேண்டும். இலக்கு வரிசைகள் அல்லது பெருக்க தயாரிப்புகளின் குறுக்கு மாசுபாடு: இந்த மாசுபாட்டிற்கு இரண்டு காரணங்கள் உள்ளன: முதலில், முழு மரபணு அல்லது பெரிய துண்டுகளின் குறுக்கு-மாசுபாடு, தவறான நேர்மறைகளுக்கு வழிவகுக்கிறது. இந்த தவறான நேர்மறையை பின்வரும் முறைகள் மூலம் தீர்க்க முடியும்: இலக்கு வரிசையை மாதிரி துப்பாக்கியில் உறிஞ்சப்படுவதையோ அல்லது மையவிலக்கு குழாயிலிருந்து தெறிக்கப்படுவதையோ தடுக்க செயல்படும்போது கவனமாகவும் மென்மையாகவும் இருங்கள். அதிக வெப்பநிலையைத் தாங்க முடியாத நொதிகள் மற்றும் பொருட்களைத் தவிர, அனைத்து எதிர்வினைகள் அல்லது உபகரணங்களும் உயர் அழுத்தத்தால் கிருமி நீக்கம் செய்யப்பட வேண்டும். அனைத்து மையவிலக்கு குழாய்கள் மற்றும் மாதிரி ஊசி குழாய் குறிப்புகள் ஒரு முறை பயன்படுத்தப்பட வேண்டும். தேவைப்பட்டால், தற்போதுள்ள நியூக்ளிக் அமிலங்களை அழிக்க மாதிரியைச் சேர்ப்பதற்கு முன், எதிர்வினை குழாய்கள் மற்றும் எதிர்வினைகள் புற ஊதா ஒளியால் கதிரியக்கப்படுகின்றன. இரண்டாவது நியூக்ளிக் அமிலங்களின் சிறிய துண்டுகள் காற்றில் மாசுபடுவது. இந்த சிறிய துண்டுகள் இலக்கு வரிசையை விட சிறியவை, ஆனால் சில ஹோமோலஜி கொண்டவை. அவை ஒன்றோடொன்று பிரிக்கப்படலாம், மேலும் ப்ரைமர்களுக்குப் பிறகு, PCR தயாரிப்புகள் பெருக்கப்படலாம், இதன் விளைவாக தவறான நேர்மறைகள் ஏற்படலாம், இது உள்ளமை PCR முறைகளால் குறைக்கப்படலாம் அல்லது அகற்றப்படலாம்.

 

3.குறிப்பிடாத பெருக்க பட்டைகள் தோன்றும் PCR பெருக்கத்திற்கு பிறகு தோன்றும் பட்டைகள் எதிர்பார்த்த அளவு பெரியதாகவோ அல்லது சிறியதாகவோ ஒத்துப்போகவில்லை அல்லது குறிப்பிட்ட பெருக்க பட்டைகள் மற்றும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்க பட்டைகள் இரண்டும் ஒரே நேரத்தில் தோன்றும். குறிப்பிடப்படாத பட்டைகள் தோன்றுவதற்கான காரணங்கள்: முதலாவதாக, ப்ரைமர்கள் இலக்கு வரிசைக்கு முழுமையாக நிரப்பவில்லை அல்லது ப்ரைமர்கள் டைமர்களை உருவாக்குகின்றன. இரண்டாவது காரணம், Mg2+ அயன் செறிவு மிக அதிகமாக உள்ளது, அனீலிங் வெப்பநிலை மிகவும் குறைவாக உள்ளது மற்றும் PCR சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கை மிக அதிகமாக உள்ளது. இரண்டாவது காரணி நொதியின் தரம் மற்றும் அளவு. சில மூலங்களிலிருந்து வரும் நொதிகள் பெரும்பாலும் குறிப்பிட்ட அல்லாத பட்டைகளுக்கு ஆளாகின்றன ஆனால் மற்ற மூலங்களிலிருந்து வரும் நொதிகள் அவ்வாறு செய்வதில்லை. அதிகப்படியான நொதிகள் சில நேரங்களில் குறிப்பிட்ட அல்லாத பெருக்கத்திற்கு வழிவகுக்கும். எதிர் நடவடிக்கைகளில் பின்வருவன அடங்கும்: தேவைப்பட்டால் ப்ரைமர்களை மறுவடிவமைப்பு செய்யவும். நொதியின் அளவைக் குறைக்கவும் அல்லது அதை வேறு மூலத்துடன் மாற்றவும். ப்ரைமர்களின் அளவைக் குறைக்கவும், வார்ப்புருவின் அளவை சரியான முறையில் அதிகரிக்கவும் மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையைக் குறைக்கவும். அனீலிங் வெப்பநிலையை சரியான முறையில் அதிகரிக்கவும் அல்லது இரண்டு-வெப்பநிலைப் புள்ளி முறையைப் பயன்படுத்தவும் (93°C, அனீலிங் மற்றும் நீட்டிப்பு சுமார் 65°C).

 

4.Flaky இழுவை அல்லது ஸ்மியர்ஸ் தோன்றும் PCR பெருக்கம் சில நேரங்களில் smeared பட்டைகள், தாள் போன்ற பட்டைகள் அல்லது தரைவிரிப்பு போன்ற பட்டைகள் தோன்றும். அதிக நொதிகள் அல்லது நொதியின் தரம் குறைவு, மிக அதிக dNTP செறிவு, மிக அதிக Mg2+ செறிவு, மிகக் குறைந்த அனீலிங் வெப்பநிலை மற்றும் பல சுழற்சிகள் ஆகியவற்றால் காரணங்கள் பெரும்பாலும் ஏற்படுகின்றன. எதிர் நடவடிக்கைகளில் பின்வருவன அடங்கும்: ① நொதியின் அளவைக் குறைக்கவும் அல்லது நொதியை வேறு மூலத்துடன் மாற்றவும். ②dNTPயின் செறிவைக் குறைக்கவும். Mg2+ செறிவை சரியான முறையில் குறைக்கவும். வார்ப்புருக்களின் அளவை அதிகரிக்கவும் மற்றும் சுழற்சிகளின் எண்ணிக்கையை குறைக்கவும்