PCR Maswali Yanayoulizwa Mara kwa Mara 1. Hasi ya uwongo, hakuna bendi ya ukuzaji inaonekana 2. Chanya isiyo ya kweli 3. Mikanda ya ukuzaji isiyo mahususi inaonekana 4. Vipande vya kuburuta visivyobadilika au vipande vya kupaka huonekana:

1Hasi ya uwongo, hakuna mkanda ulioimarishwa unaoonekana Vipengele muhimu vya majibu ya PCR ni

① utayarishaji wa kiolezo cha asidi nucleic

② ubora wa kwanza na umaalum

③ ubora wa kimeng'enya na

④ Masharti ya mzunguko wa PCR. Ili kupata sababu, uchambuzi na utafiti unapaswa kufanywa kwenye viungo hapo juu.

Kiolezo:

① Kiolezo kina protini chafu

② Kiolezo kina vizuizi vya kimeng'enya vya Taq

③ Protini zilizo kwenye kiolezo hazikusagishwi na kuondolewa, hasa histones katika kromosomu.

④ Mengi sana ilipotea wakati wa uchimbaji na utayarishaji wa kiolezo, au phenoli ilivutwa

⑤Kiolezo cha asidi nucleiki hakijabadilishwa kabisa. Wakati ubora wa enzymes na primers ni nzuri, ikiwa bendi za amplification hazionekani, kuna uwezekano mkubwa kwamba kuna kitu kibaya na mchakato wa digestion ya sampuli au mchakato wa uchimbaji wa asidi ya nucleic ya template. Kwa hiyo, suluhisho la ufanisi na imara la digestion lazima liandaliwe, na utaratibu unapaswa kudumu na usibadilishwe kwa mapenzi. . Uzinduzi wa enzyme: Ni muhimu kuchukua nafasi ya kimeng'enya kipya, au kutumia vimeng'enya vya zamani na vipya kwa wakati mmoja ili kuchanganua ikiwa hasi za uwongo husababishwa na upotezaji au ukosefu wa shughuli za kimeng'enya. Ikumbukwe kwamba wakati mwingine kimeng'enya cha Taq husahauliwa.Vipimo vya msingi: Ubora wa awali, ukolezi wa primer, na kama viwango vya vianzio viwili ni linganifu ni sababu za kawaida za kushindwa kwa PCR au kanda za ukuzaji zisizoridhisha na usambaaji rahisi. Kuna matatizo na ubora wa usanisi wa primer katika batches fulani. Moja ya primers mbili ina mkusanyiko wa juu na nyingine ina mkusanyiko mdogo, na kusababisha amplification ya chini ya asymmetric.

Hatua za kukabiliana nazo ni:

① Chagua kitengo kizuri cha usanisi cha utangulizi.

② Mkusanyiko wa primers haipaswi kuangalia tu thamani ya OD, lakini pia makini na suluhisho la hisa la primer kwa electrophoresis ya gel ya agarose. Lazima kuwe na bendi za primer, na mwangaza wa bendi mbili za primer unapaswa kuwa takribani sawa. Kwa mfano, primer moja ina bendi na primer nyingine haina bendi. Kwa vipande, PCR inaweza kushindwa kwa wakati huu na inapaswa kutatuliwa kwa mazungumzo na kitengo cha usanisi cha primer. Ikiwa primer moja ina mwangaza wa juu na nyingine ina mwangaza mdogo, sawazisha viwango wakati wa kuondokana na primers.

③ Primers zinapaswa kuhifadhiwa katika mkusanyiko wa juu na kiasi kidogo ili kuzuia kufungia mara kwa mara na kuyeyuka au uhifadhi wa muda mrefu kwenye jokofu, ambayo inaweza kusababisha kuzorota na uharibifu wa primers.

④Muundo wa kianzilishi haukubaliki, kama vile urefu wa kitangulizi hautoshi, vipima sauti huundwa kati ya vianzio, n.k. Mkusanyiko wa Mg2+: Mkusanyiko wa ioni wa Mg2+ una ushawishi mkubwa kwenye ufanisi wa ukuzaji wa PCR. Ikiwa ukolezi ni wa juu sana, inaweza kupunguza umaalumu wa ukuzaji wa PCR. Ikiwa mkusanyiko ni mdogo sana, itaathiri mavuno ya ukuzaji wa PCR na hata kusababisha ukuzaji wa PCR kushindwa bila bendi za kukuza. Mabadiliko katika sauti ya majibu: Kwa kawaida juzuu zinazotumiwa kwa ukuzaji wa PCR ni 20ul, 30ul, na 50ul. Au 100ul, kiasi gani kinafaa kutumika kwa ukuzaji wa PCR huwekwa kulingana na madhumuni tofauti ya utafiti wa kisayansi na majaribio ya kimatibabu. Baada ya kutengeneza kiasi kidogo, kama vile 20ul, na kisha kufanya kiasi kikubwa, lazima ufuate masharti, vinginevyo itashindwa kwa urahisi. Sababu za kimwili: Urekebishaji ni muhimu sana kwa ukuzaji wa PCR. Ikiwa hali ya joto ya denaturation ni ya chini na muda wa denaturation ni mfupi, hasi za uongo zina uwezekano mkubwa wa kutokea; halijoto ya annealing ni ya chini sana, ambayo inaweza kusababisha ukuzaji usio maalum na kupunguza ufanisi maalum wa ukuzaji. Halijoto ya kuchuja ni ya juu sana. Huathiri sana ufungaji wa vianzio kwenye violezo na kupunguza ufanisi wa ukuzaji wa PCR. Wakati mwingine ni muhimu kutumia thermometer ya kawaida ili kuangalia denaturation, annealing na joto la ugani katika amplifier au sufuria ya maji. Hii pia ni moja ya sababu za kushindwa kwa PCR. Tofauti ya mfuatano unaolengwa: Ikiwa mfuatano lengwa utabadilishwa au kufutwa, jambo ambalo linaathiri ufungaji mahususi wa kianzio kwenye kiolezo, au kitangulizi na kiolezo kinapoteza mfuatano wa ziada kutokana na kufutwa kwa sehemu fulani ya mfuatano lengwa, ukuzaji wa PCR. haitafanikiwa.

2.chanya ya uwongo Mkanda wa ukuzaji wa PCR unaoonekana unawiana na mkanda wa mfuatano unaolengwa, na wakati mwingine bendi huwa ya mpangilio na angavu zaidi. Muundo wa kitangulizi usiofaa: Mfuatano wa ukuzaji uliochaguliwa una homolojia na mfuatano wa ukuzaji usiolengwa, kwa hivyo wakati wa kutekeleza ukuzaji wa PCR, bidhaa ya PCR iliyokuzwa ni mfuatano usiolengwa. Ikiwa mfuatano lengwa ni mfupi sana au kitangulizi ni kifupi sana, chanya za uwongo zinaweza kutokea kwa urahisi. Primers zinahitaji kuundwa upya. Uchafuzi mtambuka wa mfuatano lengwa au bidhaa za ukuzaji: Kuna sababu mbili za uchafuzi huu: Kwanza, uchafuzi mtambuka wa jenomu nzima au vipande vikubwa, na kusababisha chanya za uwongo. Chanya hii ya uwongo inaweza kutatuliwa kwa njia zifuatazo: Kuwa mwangalifu na mpole unapofanya kazi ili kuzuia mlolongo unaolengwa usinyweshwe kwenye sampuli ya bunduki au kumwagika nje ya bomba la centrifuge. Isipokuwa kwa enzymes na vitu ambavyo haviwezi kuhimili joto la juu, vitendanishi vyote au vifaa vinapaswa kuwa sterilized na shinikizo la juu. Mirija yote ya centrifuge na vidokezo vya bomba za sindano za sampuli zinapaswa kutumika mara moja. Ikiwa ni lazima, mirija ya majibu na vitendanishi huwashwa na mwanga wa ultraviolet kabla ya kuongeza sampuli ili kuharibu asidi ya nucleic iliyopo. Ya pili ni uchafuzi wa vipande vidogo vya asidi ya nucleic katika hewa. Vipande hivi vidogo ni vifupi kuliko mlolongo unaolengwa, lakini vina homolojia fulani. Wanaweza kuunganishwa kwa kila mmoja, na baada ya kuwa nyongeza kwa primers, bidhaa za PCR zinaweza kuimarishwa, na kusababisha matokeo ya uongo, ambayo yanaweza kupunguzwa au kuondolewa kwa njia za PCR zilizowekwa.

 

3.Bendi za ukuzaji zisizo maalum zinaonekana Mikanda inayoonekana baada ya ukuzaji wa PCR haiwiani na ukubwa unaotarajiwa, ama kubwa au ndogo, au bendi maalum za ukuzaji na bendi za ukuzaji zisizo maalum huonekana kwa wakati mmoja. Sababu za kuonekana kwa bendi zisizo maalum ni: kwanza, primers si kamili kabisa kwa mlolongo wa lengo, au primers jumla ya jumla ya kuunda dimers. Sababu ya pili ni kwamba ukolezi wa ioni ya Mg2+ ni wa juu sana, halijoto ya annealing ni ya chini sana, na idadi ya mizunguko ya PCR ni kubwa mno. Jambo la pili ni ubora na wingi wa enzyme. Enzymes kutoka kwa vyanzo vingine mara nyingi huathirika na bendi zisizo maalum lakini vimeng'enya kutoka kwa vyanzo vingine havielewi. Kiasi kikubwa cha vimeng'enya wakati mwingine kinaweza kusababisha ukuzaji usio maalum. Hatua za kukabiliana ni pamoja na: tengeneza upya vianzio ikiwa ni lazima. Punguza kiasi cha kimeng'enya au ubadilishe na chanzo kingine. Punguza kiasi cha vianzio, ongeza kiasi cha kiolezo ipasavyo, na punguza idadi ya mizunguko. Ongeza halijoto ya kuchuja kwa njia ipasavyo au tumia mbinu ya sehemu za halijoto mbili (mchezo ifikapo 93°C, uwekaji wa anneal na upanuzi karibu 65°C).

 

4. Uvutaji hafifu au smears huonekana Ukuzaji wa PCR wakati mwingine huonekana kama mikanda iliyopakwa, mikanda inayofanana na laha au mikanda inayofanana na zulia. Sababu mara nyingi husababishwa na kimeng'enya kingi au ubora duni wa kimeng'enya, ukolezi wa juu sana wa dNTP, ukolezi wa juu sana wa Mg2+, halijoto ya chini sana ya annealing, na mizunguko mingi sana. Hatua za kukabiliana ni pamoja na: ① Punguza kiwango cha kimeng'enya, au ubadilishe kimeng'enya na chanzo kingine. ②Punguza mkusanyiko wa dNTP. Punguza ipasavyo mkusanyiko wa Mg2+. Ongeza idadi ya violezo na kupunguza idadi ya mizunguko