FAQ PCR 1. Negatif palsu, teu aya pita amplifikasi anu muncul 2. Positip palsu 3. Pita amplifikasi non-spésifik muncul 4. Jalur sered flaky atanapi jalur smear muncul:

1Palsu négatip, euweuh pita amplified mucunghul Aspék konci réaksi PCR nyaéta

① persiapan asam nukléat citakan

② kualitas primér sarta spésifisitas

③ kualitas énzim jeung

④ kaayaan siklus PCR. Pikeun manggihan alesanana, analisis jeung panalungtikan ogé kudu dilaksanakeun dina tumbu di luhur.

Citakan:

① Citakan ngandung protéin najis

② Citakan ngandung inhibitor énzim Taq

③ Protéin dina citakan henteu dicerna sareng dipiceun, khususna histones dina kromosom.

④ Loba teuing leungit salila ékstraksi jeung persiapan citakan, atawa fénol kaseuseup

⑤Asam nukléat citakan teu lengkep didenaturasi. Nalika kualitas énzim sareng primer saé, upami pita amplifikasi henteu muncul, sigana aya anu lepat sareng prosés nyerna spésimén atanapi prosés ékstraksi asam nukléat citakan. Ku alatan éta, hiji solusi nyerna éféktif jeung stabil kudu disiapkeun, sarta prosedur kudu dibereskeun jeung teu kudu dirobah di will. . Inactivation énzim: Perlu ngagentos énzim énggal, atanapi nganggo énzim anu lami sareng énggal dina waktos anu sami pikeun nganalisis naha négatip palsu disababkeun ku leungitna atanapi henteu cekap kagiatan énzim. Ieu kudu dicatet yén kadang énzim Taq poho.Primers: kualitas Primer, konsentrasi primer, jeung naha konsentrasi dua primers simetris mangrupakeun alesan umum pikeun gagalna PCR atawa pita amplifikasi unsatisfactory sarta difusi gampang. Aya masalah sareng kualitas sintésis primer dina sababaraha bets. Salah sahiji dua primers boga konsentrasi luhur sarta séjén boga konsentrasi low, hasilna low-efisiensi amplifikasi asimétri.

The countermeasures nyaéta:

① Pilih unit sintésis primer anu saé.

② Konsentrasi primers teu kudu ngan kasampak di nilai OD, tapi ogé nengetan solusi stock primer pikeun éléktroforésis gél agarose. Kedah aya pita primer, sareng kacaangan dua pita primer kedah kasarna sami. Contona, hiji primer boga pita sarta primer séjén teu boga pita. Pikeun strips, PCR bisa gagal dina waktu ieu sarta kudu direngsekeun ngaliwatan badami jeung unit sintésis primer. Lamun hiji primer boga kacaangan luhur sarta séjén boga kacaangan low, saimbangkeun konsentrasi nalika éncér primers.

③ Primer kudu disimpen dina konsentrasi luhur jeung jumlah leutik pikeun nyegah katirisan terus-terusan jeung thawing atawa neundeun jangka panjang dina kulkas, nu bisa ngakibatkeun deterioration jeung degradasi primers.

④Desain primer teu munasabah, kayaning panjang primer teu cukup, dimer kabentuk antara primers, jsb konsentrasi Mg2 +: Mg2 + konsentrasi ion boga pangaruh hébat kana efisiensi amplifikasi PCR. Upami konsentrasina luhur teuing, éta tiasa ngirangan spésifisitas amplifikasi PCR. Upami konsentrasina rendah teuing, éta bakal mangaruhan ngahasilkeun amplifikasi PCR bahkan nyababkeun amplifikasi PCR gagal tanpa ngagedekeun pita. Parobahan volume réaksi: Biasana volume anu digunakeun pikeun amplifikasi PCR nyaéta 20ul, 30ul, sareng 50ul. Atanapi 100ul, volume naon anu kedah dianggo pikeun amplifikasi PCR diatur dumasar kana tujuan anu béda pikeun panalungtikan ilmiah sareng uji klinis. Saatos ngadamel volume leutik, sapertos 20ul, teras ngadamel volume anu langkung ageung, anjeun kedah nuturkeun syaratna, upami henteu bakal gampang gagal. Alesan fisik: Denaturasi penting pisan pikeun amplifikasi PCR. Upami suhu denaturasi rendah sareng waktos denaturasi pondok, négatif palsu kamungkinan pisan kajantenan; suhu annealing teuing low, nu bisa ngabalukarkeun Gedekeun non-spésifik sarta ngurangan efisiensi Gedekeun husus. Suhu annealing luhur teuing. Kacida mangaruhan beungkeutan primers kana témplat sareng ngirangan efisiensi amplifikasi PCR. Kadang-kadang perlu ngagunakeun térmométer standar pikeun mariksa suhu denaturasi, annealing sareng extension dina amplifier atanapi pot larut cai. Ieu ogé salah sahiji alesan pikeun gagalna PCR. Variasi runtuyan udagan: Upami sekuen targét mutasi atanapi ngahapus, anu mangaruhan beungkeutan spésifik tina primer kana citakan, atanapi primer sareng témplat leungiteun sekuen pelengkap kusabab ngahapus bagéan tina sekuen target, amplifikasi PCR. moal suksés.

2.palsu positif Pita amplifikasi PCR anu muncul konsisten sareng pita urutan udagan, sareng kadang pita langkung teratur sareng langkung terang. Desain primer teu pantes: Runtuyan amplifikasi nu dipilih boga homologi jeung runtuyan amplifikasi non-target, jadi nalika ngalakukeun amplifikasi PCR, produk PCR amplified mangrupa runtuyan non-target. Lamun runtuyan target pondok teuing atawa primer teuing pondok, positip palsu bisa gampang lumangsung. Primer kudu didesain ulang. Kontaminasi silang tina sekuen target atanapi produk amplifikasi: Aya dua alesan pikeun kontaminasi ieu: Kahiji, kontaminasi silang sadayana génom atanapi fragmén ageung, ngarah kana positip palsu. Positip palsu ieu tiasa direngsekeun ku cara-cara di handap ieu: Kudu ati-ati sareng lemah lembut nalika operasi pikeun nyegah sekuen target disedot kana bedil sampel atanapi disemprotkeun tina tabung centrifuge. Kacuali énzim sareng zat anu henteu tahan suhu anu luhur, sadaya réagen atanapi alat kedah disterilisasi ku tekanan anu luhur. Sadaya tabung centrifuge sareng tip pipette suntikan sampel kedah dianggo sakali. Upami diperlukeun, tabung réaksi sareng réagen disinari ku sinar ultraviolét sateuacan nambihan spésimén pikeun ngancurkeun asam nukléat anu aya. Anu kadua nyaéta kontaminasi fragmen leutik asam nukléat dina hawa. Ieu fragmen leutik leuwih pondok batan runtuyan sasaran, tapi mibanda homologi tangtu. Éta tiasa dihijikeun ka silih, sareng saatos pelengkap kana primer, produk PCR tiasa digedékeun, hasilna positip palsu, anu tiasa dikirangan atanapi dileungitkeun ku metode PCR nested.

 

3. Pita amplifikasi non-spésifik muncul Pita-pita anu muncul sanggeus amplifikasi PCR teu saluyu jeung ukuran nu dipiharep, boh nu leuwih gede atawa leuwih leutik, atawa duanana pita amplifikasi husus jeung pita amplifikasi non-spésifik muncul sakaligus. Alesan pikeun munculna pita non-spésifik nyaéta: kahiji, primers teu lengkep pelengkap runtuyan target, atawa primers agrégat pikeun ngabentuk dimer. Alesan kadua nyaéta konsentrasi ion Mg2+ teuing tinggi, suhu annealing teuing low, sarta jumlah siklus PCR teuing tinggi. Faktor kadua nyaéta kualitas sareng kuantitas énzim. Énzim tina sababaraha sumber sering rawan kana pita non-spésifik tapi énzim tina sumber sanés henteu. Jumlah énzim kaleuleuwihan kadang bisa ngakibatkeun amplifikasi non-spésifik. The countermeasures ngawengku: redesign primers lamun perlu. Ngurangan jumlah énzim atawa ngaganti eta ku sumber séjén. Ngurangan jumlah primers, ningkatkeun jumlah template appropriately, sarta ngurangan jumlah siklus. Ningkatkeun suhu annealing kalayan leres atanapi nganggo metode titik dua suhu (denaturasi dina 93°C, annealing sareng ekstensi sakitar 65°C).

 

4.Sered flaky atanapi smears muncul amplifikasi PCR kadang muncul salaku pita smeared, pita-kawas lembar atawa pita-kawas karpét. Alesanna sering disababkeun ku seueur teuing énzim atanapi kualitas énzim anu goréng, konsentrasi dNTP anu luhur teuing, konsentrasi Mg2+ anu luhur teuing, suhu anil teuing rendah, sareng seueur teuing siklus. Penanggulangan nyaéta: ① Ngurangan jumlah énzim, atanapi ngagentos énzim ku sumber sanés. ② Ngurangan konsentrasi dNTP. Sacukupna ngurangan konsentrasi Mg2+. Ningkatkeun jumlah témplat sareng ngirangan jumlah siklus