PCR FAQ 1. Phoso e fosahetseng, ha ho letlapa la amplification le hlahang 2. False positive 3. Li-band tsa amplification tse sa totobalang lia hlaha 4. Ho hlaha likhoele tse khoehlang kapa li-smear strips:
1Ha e mpe, ha ho na sehlopha se holisitsoeng se hlahang Lintlha tsa bohlokoa tsa karabelo ea PCR ke
① ho lokisoa ha template ea nucleic acid
② boleng ba pele le ho khetheha
③ boleng ba enzyme le
④ Maemo a potoloho ea PCR. Ho fumana mabaka, tlhahlobo le lipatlisiso le tsona li lokela ho etsoa lihokelong tse kaholimo.
Setšoantšo:
① Setšoantšo se na le liprotheine tse sa hloekang
② Setšoantšo se na le li-inhibitors tsa Taq enzyme
③ Liprotheine tse ka har'a template ha li chekoe ebile ha li tlosoe, haholo li-histones tse ka har'a chromosome.
④ Ho ile ha lahleha ho hongata haholo nakong ea ho ntšoa le ho lokisoa ha template, kapa phenol e ile ea huleloa
⑤ Nucleic acid ea template ha e na denatured ka ho feletseng. Ha boleng ba li-enzyme le li-primers bo le ntle, haeba lihlopha tsa amplification li sa hlahe, ho ka etsahala hore ebe ho na le ho hong ho phoso ka ts'ebetso ea tšilo ea mohlala kapa mokhoa oa ho ntšoa ha template ea nucleic acid. Ka hona, tharollo e sebetsang le e tsitsitseng ea tšilo ea lijo e tlameha ho lokisoa, 'me mokhoa ona o lokela ho lokisoa' me ha oa lokela ho fetoloa ka thato. . Ho se sebetse ha enzyme: Hoa hlokahala ho nkela enzyme e ncha sebaka, kapa ho sebelisa li-enzyme tsa khale le tse ncha ka nako e le 'ngoe ho hlahloba hore na li-negative tsa bohata li bakoa ke tahlehelo kapa ts'ebetso e sa lekaneng ea enzyme. Ho lokela ho hlokomeloa hore ka linako tse ling enzyme ea Taq e lebetsoe.Li-Primers: Boleng ba pele, mahloriso a pele, le hore na likhahla tsa li-primers tse peli li lekana ke mabaka a tloaelehileng a ho hlōleha ha PCR kapa lihlopha tse sa khotsofatseng tsa amplification le ho hasana habonolo. Ho na le mathata ka boleng ba primer synthesis ka har'a lihlopha tse ling. E 'ngoe ea li-primers tse peli e na le mahloriso a phahameng' me e 'ngoe e na le khatello e tlase, e bakang ho holisa asymmetric ho sa sebetseng hantle.
Mehato ea ho thibela ke:
① Khetha yuniti e ntle ea ho kopanya.
② Lekhalo la li-primers ha lea lokela ho sheba feela boleng ba OD, empa hape le ela hloko tharollo ea lihlahisoa tsa agarose gel electrophoresis. Ho tlameha ho ba le li-primer band, 'me khanya ea lihlopha tse peli tsa li-primer e lokela ho batla e tšoana. Ka mohlala, primer e 'ngoe e na le sehlopha' me e 'ngoe ha e na sehlopha. Bakeng sa li-strips, PCR e ka 'na ea hlōleha ka nako ena' me e lokela ho rarolloa ka lipuisano le yuniti ea pele ea ho kopanya. Haeba primer e le 'ngoe e na le khanya e phahameng' me e 'ngoe e na le khanya e tlase, leka-lekanya likhakanyo ha u hlapolla li-primers.
③ Li-primers li lokela ho bolokoa ka bongata bo boholo le ka bongata bo fokolang ho thibela serame khafetsa le ho qhibiliha kapa ho boloka nako e telele ka sehatsetsing, e leng se ka lebisang ho senyeha le ho senyeha ha li-primers.
④Moqapi oa primer ha o utloahale, joalo ka ha bolelele ba primer ha boa lekana, dimers li thehoa pakeng tsa li-primers, joalo-joalo. Mg2 + concentration: Mg2 + ion concentration: Mg2 + ion concentration e na le tšusumetso e kholo ho matla a amplification a PCR. Haeba mahloriso a phahame haholo, a ka fokotsa ho khetheha ha PCR amplification. Haeba mahloriso a le tlase haholo, e tla ama tlhahiso ea PCR ea amplification esita le ho etsa hore amplification ea PCR e hlolehe ntle le ho holisa lihlopha. Liphetoho tsa molumo oa karabelo: Hangata li-volumes tse sebelisoang ho holisa PCR ke 20ul, 30ul, le 50ul. Kapa 100ul, hore na ke molumo ofe o lokelang ho sebelisoa bakeng sa ho hōlisa PCR e behiloe ho latela merero e fapaneng ea lipatlisiso tsa saense le tlhahlobo ea bongaka. Ka mor'a ho etsa molumo o monyenyane, o kang 20ul, ebe o etsa molumo o moholoanyane, o tlameha ho latela maemo, ho seng joalo o tla hlōleha habonolo. Mabaka a 'mele: Denaturation e bohlokoa haholo bakeng sa ho holisa PCR. Haeba mocheso oa denaturation o le tlase 'me nako ea denaturation e khuts'oane, ho ka etsahala hore ho be le mathata a fosahetseng; Thempereichara ea annealing e tlase haholo, e ka bakang matlafatso e sa khetheheng le ho fokotsa katleho e khethehileng ea amplification. Thempereichara ea annealing e phahame haholo. E ama haholo tlamahano ea li-primer ho litempele mme e fokotsa ts'ebetso ea ntlafatso ea PCR. Ka linako tse ling hoa hlokahala ho sebelisa thermometer e tloaelehileng ho lekola denaturation, annealing le lithemparetjha tse atolositsoeng ka har'a amplifier kapa pitsa e qhibilihang ka metsi. Hona hape ke le leng la mabaka a etsang hore PCR e hlolehe. Phapang ea tatelano ea sepheo: Haeba tatelano ea sepheo e fetotsoe kapa e hlakoloa, e amang tlamo e khethehileng ea primer ho thempleite, kapa primer le template li lahleheloa ke tatellano e tlatsetsang ka lebaka la ho hlakoloa ha karolo e itseng ea tatellano ea sepheo, ntlafatso ea PCR. e ke ke ea atleha.
2.false positive Sehlopha sa amplification sa PCR se hlahang se lumellana le sehlopha sa tatellano ea sepheo, 'me ka linako tse ling sehlopha se hlophisehile le ho feta. Moralo o sa nepahalang oa li-primer: Tatelano e khethiloeng ea amplification e na le homology le tatellano ea matlafatso e sa lebelloang, kahoo ha o etsa amplification ea PCR, sehlahisoa sa PCR se atolositsoeng ke tatellano eo e seng sepheo. Haeba tatellano ea tatellano e le khuts'oane haholo kapa "primer" e le khuts'oane haholo, ho ka hlaha lintlha tse fosahetseng. Li-primers li hloka ho hlophisoa bocha. Tšilafalo e fapa-fapaneng ea tatellano ea sepheo kapa lihlahisoa tsa ho hōlisa: Ho na le mabaka a mabeli a tšilafalo ena: Ea pele, tšilafalo e fapa-fapaneng ea liphatsa tsa lefutso kapa likaroloana tse kholo, tse lebisang ho tse fosahetseng. Phoso ena e fosahetseng e ka rarolloa ka mekhoa e latelang: E-ba hlokolosi 'me u be bonolo ha u sebetsa ho thibela tatellano ea sepheo hore e se ke ea kenngoa ka har'a sethunya sa sampole kapa ho fafatsoa ka har'a tube ea centrifuge. Ntle le li-enzyme le lintho tse ke keng tsa mamella mocheso o phahameng, li-reagents tsohle kapa lisebelisoa li lokela ho hloekisoa ka khatello e phahameng. Li-tubes tsohle tsa centrifuge le malebela a sampuli ea ente ea pipette li lokela ho sebelisoa hang. Haeba ho hlokahala, li-tubes tsa reaction le li-reagents li khantšitsoe ka leseli la ultraviolet pele li eketsa mohlala ho senya li-nucleic acid tse teng. Ea bobeli ke ho silafala ha likaroloana tse nyenyane tsa nucleic acid tse moeeng. Likaroloana tsena tse nyane li khuts'oane ho feta tatellano e reriloeng, empa li na le homology e itseng. Li ka aroloa ho tse ling, 'me ka mor'a hore li tlatselle li-primers, lihlahisoa tsa PCR li ka matlafatsoa, tsa fella ka lintlha tse fosahetseng, tse ka fokotsoang kapa tsa felisoa ka mekhoa ea PCR ea sehlaha.
3. Li-band tsa amplification tse sa khetheheng li hlaha Lihlopha tse hlahang ka mor'a hore PCR e phahamisoe ha e lumellane le boholo bo lebeletsoeng, ebang ke e kholoanyane kapa e nyenyane, kapa lihlopha tse peli tse khethehileng tsa amplification le lihlopha tse sa khetheheng tsa amplification li hlaha ka nako e le 'ngoe. Mabaka a ho hlaha ha lihlopha tse sa khethoeng ke: pele, li-primers ha li tlatse ka ho feletseng ho tatellano ea sepheo, kapa li-primers li bokellana ho etsa dimers. Lebaka la bobeli ke hore mahloriso a Mg2 + ion a phahame haholo, mocheso oa annealing o tlase haholo, 'me palo ea lipotoloho tsa PCR e phahame haholo. Ntlha ea bobeli ke boleng le bongata ba enzyme. Li-enzyme tse tsoang mehloling e meng li atisa ho ba lihlopha tse sa khetheheng empa li-enzyme tse tsoang mehloling e meng ha li joalo. Li-enzyme tse ngata haholo ka linako tse ling li ka lebisa ho holisang ho sa tobang. Mehato ea ho hanyetsa e kenyelletsa: ho lokisa li-primers ha ho hlokahala. Fokotsa palo ea enzyme kapa u e nkele sebaka ka mohloli o mong. Fokotsa palo ea li-primers, eketsa palo ea template ka nepo, 'me u fokotse palo ea lipotoloho. Eketsa mocheso o kenang ka mokhoa o nepahetseng kapa sebelisa mokhoa oa lintlha tse peli tsa mocheso (denaturation ho 93 ° C, annealing le katoloso e ka bang 65 ° C).
4.Flaky hula kapa smears hlaha PCR amplification ka linako tse ling e hlaha e le lihlopha tse tlotsitsoeng, lihlopha tse kang lakane kapa lihlopha tse kang k'hapete. Mabaka a atisa ho bakoa ke enzyme e ngata haholo kapa boleng bo bobe ba enzyme, khatello e phahameng haholo ea dNTP, khatello e phahameng ea Mg2 +, mocheso o tlase haholo oa annealing, le lipotoloho tse ngata haholo. Mehato ea ho thibela e kenyeletsa: ① Fokotsa bongata ba enzyme, kapa u nke sebaka sa enzyme ka mohloli o mong. ② Fokotsa khatello ea maikutlo ea dNTP. Ka nepo fokotsa khatello ea Mg2 +. Eketsa palo ea litempele le ho fokotsa palo ea lipotoloho
