FAQ PCR 1. Fa'ase'e le lelei, leai se fa'asili fa'apupulaina e aliali mai 2. Fa'ase'e lelei 3. Fa'ailoga fa'aupu fa'aola fa'apitoa e aliali mai 4. O lo'o aliali mai ni fasi toso fa'alilolilo po'o ni fasi fasi pepa:

1Sese le lelei, leai se fusi fa'aopoopo e aliali mai O itu taua o le tali PCR o

① saunia o mamanu nucleic acid

② tulaga muamua ma faʻapitoa

③ enzyme lelei ma

④ tulaga ta'amilosaga PCR. Ina ia maua mafuaʻaga, auʻiliʻiliga ma suʻesuʻega e tatau foi ona faia i luga o fesoʻotaʻiga i luga.

Fa'ata'ita'iga:

① O le mamanu o loʻo i ai polotini le mama

② O le faʻataʻitaʻiga e iai Taq enzyme inhibitors

③ O polotini o loʻo i totonu o le faʻataʻitaʻiga e leʻo faʻafefe ma aveese, aemaise lava o faʻamaumauga i chromosomes

④ Ua tele naua mea na leiloa i le taimi o le aveeseina ma le saunia o le mamanu, poo le phenol na manavaina

⑤O le mamanu nucleic acid e le'o fa'amuta atoa. A lelei le tulaga lelei o enzymes ma primers, afai e le aliali mai fusi faʻapipiʻi, e foliga mai o loʻo i ai se mea o loʻo i ai se mea sese i le faʻagasologa o le faʻaogaina o le faʻataʻitaʻiga poʻo le faʻataʻitaʻiga o le faʻaogaina o le nucleic acid process. O le mea lea, e tatau ona saunia se vaifofo lelei ma mautu, ma e tatau ona faʻamautu le faiga ma e le tatau ona suia i le loto. . Enzyme inactivation: E tatau ona sui le enzyme fou, poʻo le faʻaaogaina uma o enzymes tuai ma fou i le taimi e tasi e iloilo ai pe faʻaletonu sese e mafua mai i le gau poʻo le le lava o le gaioiga o le enzyme. E tatau ona maitauina o nisi taimi e galo ai le enzyme Taq.Primers: Primer quality, primer concentration, ma pe o le fa'auluuluga o le primers e lua e symmetrical o mafua'aga masani mo le PCR le manuia po'o le fa'amalieina o fusi fa'aopoopoga ma faigofie fa'asalalau. O lo'o i ai fa'afitauli i le tulaga lelei o le fa'asologa muamua i nisi vaega. O le tasi o mea muamua e lua o loʻo i ai le maualuga maualuga ae o le isi e maualalo le faʻaogaina, e mafua ai le maualalo o le asymmetric amplification.

O faiga fa'asagatau e:

① Filifili se iunite faʻapipiʻi muamua lelei.

② E le gata ina vaʻavaʻai i le tau o le OD le faʻatonuga o mea faʻapitoa, ae faʻalogo foi i le faʻasoa faʻatau muamua mo le electrophoresis gel agarose. E tatau ona i ai ni fusi muamua, ma o le susulu o fusi muamua e lua e tatau ona tutusa. Mo se faʻataʻitaʻiga, o le tasi primer e iai se fusi ae o le isi faʻailoga e leai se fusi. Mo fasipepa, atonu e le manuia le PCR i le taimi nei ma e tatau ona foia e ala i feutagaiga ma le vaega muamua o le synthesis. Afai e maualuga le susulu o le tasi tusi muamua ae maualalo le malamalama o le isi, faapaleni le fa'atonuga pe a fa'afefeteina fa'amuamua.

③ E tatau ona teuina fa'aliga muamua i le maualuga ma le la'ititi la'ititi e puipuia ai le fa'amalo fa'asolosolo ma le fa'afefe po'o le teuina mo se taimi umi i totonu o le pusaaisa, lea e ono o'o atu ai i le fa'aleagaina ma le fa'aleagaina o mea muamua.

④O le mamanu muamua e le talafeagai, e pei o le umi muamua e le lava, dimers ua fausia i le va o primers, ma isi Mg2 + faʻatonuga: Mg2 + ion concentration ei ai se aafiaga tele i le PCR amplification lelei. Afai e maualuga tele le faʻatonuga, e mafai ona faʻaititia le faʻapitoa ole PCR faʻateleina. Afai e maualalo tele le faʻatonuga, o le a aʻafia ai le PCR amplification yield ma e mafua ai foi ona toilalo le PCR amplification e aunoa ma le faʻalauteleina o fusi. Suiga i le voluma tali: E masani lava o voluma o loʻo faʻaaogaina mo le PCR faʻateleina o le 20ul, 30ul, ma le 50ul. Po o le 100ul, o le a le voluma e tatau ona faʻaaogaina mo le PCR faʻalauteleina e faʻatulagaina e tusa ai ma faʻamoemoega eseese o suʻesuʻega faʻasaienisi ma suʻega falemaʻi. A maeʻa ona fai se laʻititi laʻititi, e pei o le 20ul, ona faia lea o se voluma tele, e tatau ona e mulimuli i tulaga, a leai o le a faigofie ona toilalo. Mafua'aga fa'aletino: E taua tele le fa'auigaina mo le fa'alauteleina o le PCR. Afai e maualalo le vevela o le denaturation ma e pu'upu'u le taimi o le denaturation, e foliga mai o le a tupu ni fa'aletonu sese; e maualalo tele le vevela o le annealing, lea e mafai ona mafua ai le faʻalauteleina o le le faʻapitoa ma faʻaitiitia ai le faʻaogaina o le faʻaogaina. Ua maualuga tele le vevela o le fa'afefe. E matua a'afia ai le fusifusia o fa'amatamata i fa'ata'ita'iga ma fa'aitiitia ai le fa'ateleina o le PCR. O nisi taimi e mana'omia ai le fa'aogaina o le vevela masani e siaki ai le denaturation, annealing ma le fa'alauteleina o le vevela i totonu o le amplifier po'o le ipu vai-soluble. Ole tasi lea ole mafua'aga ole faaletonu ole PCR. Su'ega fa'asologa fa'asologa: Afai e suia pe tape le fa'asologa o le fa'asologa, lea e a'afia ai le fusia fa'apitoa o le primer i le fa'ata'ita'iga, po'o le fa'amuamua ma le fa'ata'ita'iga e leiloa le fa'asologa fa'atasi ona o le tapeina o se vaega patino o le fa'asologa fa'asologa, o le fa'alauteleina o le PCR. o le a le manuia.

2.false positive O le PCR amplification band e aliali mai e ogatusa ma le fa'asologa o fa'asologa, ma o nisi taimi o le fa'aili e sili atu ona maopoopo ma susulu. Fuafuaga muamua e le talafeagai: O le fa'asologa fa'aopoopo ua filifilia o lo'o i ai le homology ma le fa'asologa o le fa'alauteleina e le o fa'atatau, o lea pe a fa'atino le fa'alauteleina o le PCR, o le oloa fa'ateleina PCR o se fa'asologa e le fa'atatau. Afai e pu'upu'u tele le fa'asologa fa'asologa po'o le pu'upu'u fo'i, e faigofie lava ona tupu ni fa'ailoga sese. E mana'omia ona toe fa'afuafuaina. Feso'ota'iga o fa'asologa o fa'asologa po'o oloa fa'ateleina: E lua mafua'aga o lenei fa'aleagaina: Muamua, fa'a'ala'au o le genome atoa po'o ni vaega tetele, e o'o atu ai i fa'ailoga sese. E mafai ona foia lea tulaga lelei i auala nei: Fa'aeteete ma agamalu pe a fa'agaioi e puipuia le fa'asologa o le fa'asologa mai le mitiia i totonu o le fana fa'ata'ita'i po'o le sausau i fafo mai le fa'agaau fa'aau. Vagana ai enzymes ma mea e le mafai ona tatalia le maualuga o le vevela, e tatau ona faʻamaʻi uma mea faʻapipiʻi poʻo meafaigaluega i le maualuga o le mamafa. E tatau ona fa'aoga tasi le fa'aoga o paipa tu'itu'i uma. Afai e mana'omia, e fa'amumuina le fa'aputuga ma mea fa'afoliga i le malamalama ultraviolet a'o le'i fa'aopoopoina le fa'ata'ita'iga e fa'aumatia ai nucleic acids o lo'o iai. O le lona lua o le faaleagaina o ni vaega laiti o nucleic acids i le ea. O nei vaega laiti e pupuu nai lo le fa'asologa fa'asologa, ae e iai ni fa'asologa fa'apitoa. E mafai ona faʻafesoʻotaʻi le tasi i le isi, ma a maeʻa ona faʻapipiʻi i mea muamua, o oloa PCR e mafai ona faʻalauteleina, e mafua ai ni mea sese, lea e mafai ona faʻaitiitia pe faʻaumatia e auala PCR nested.

 

3. Fa'apipi'i fa'aupuga fa'apitoa e fa'aalia O fusi e aliali mai pe a mae'a le fa'alauteleina o le PCR e le ogatasi ma le lapo'a fa'amoemoeina, pe lapopo'a pe la'ititi, po'o fa'amaufa'ailoga fa'apitoa fa'apitoa ma fa'aupuga fa'aopoopo e le fa'apitoa e fa'aalia i le taimi e tasi. O mafua'aga o le fa'aalia o fusi e le fa'apitoa e: muamua, e le'o atoatoa le fa'atasi o fa'amata'u i le fa'asologa fa'asologa, po'o le fa'apipi'i fa'atasi e fai ai dimer. O le mafuaaga lona lua o le Mg2 + ion concentration e maualuga tele, o le vevela o le annealing e maualalo tele, ma le numera o PCR cycles e maualuga tele. O le mea lona lua o le lelei ma le tele o le enzyme. Enzymes mai nisi puna'oa e masani ona fa'apipi'i i fusi e le fa'apitoa ae ole enzymes mai isi fa'apogai e leai. Ole tele ole enzymes e mafai i nisi taimi ona o'o atu ai ile fa'ateleina ole fa'apitoa. O faiga fa'asagatau e aofia ai: toe fa'avasega muamua pe'ā mana'omia. Faʻaitiitia le aofaʻi o le enzyme pe sui i se isi puna. Fa'aiti'itia le aofa'i o primers, fa'aopoopo le aofa'i o fa'ata'ita'iga talafeagai, ma fa'aitiitia le aofa'i o ta'amilosaga. Fa'ateleina le vevela fa'a'aluma talafeagai pe fa'aoga le auala e lua-vevela (denaturation i le 93°C, fa'amau ma fa'alautele ile 65°C).

 

4. Toso matala po'o smears e foliga mai PCR amplification o nisi taimi e foliga mai o ni fusi faʻapipiʻi, fusi pei o laupepa poʻo ni kapeta-pei o fusi. O mafuaʻaga e masani ona mafua ona o le tele o le enzyme poʻo le le lelei o le enzyme, maualuga tele le faʻaogaina o le dNTP, maualuga tele le maualuga o le Mg2+, maualalo le vevela o le faʻafefe, ma le tele o taamilosaga. O faiga fa'asagatau e aofia ai: ① Fa'aitiitia le aofa'i o le enzyme, pe sui le enzyme i se isi puna. ②Fa'aitiitia le fa'atonuga o le dNTP. Fa'aitiitiga talafeagai le fa'atonuga o le Mg2+. Faʻateleina le aofaʻi o faʻataʻitaʻiga ma faʻaititia le numera o taamilosaga