Separácia a čistenie proteínov sa široko používa v biochemickom výskume a aplikáciách a je dôležitou operačnou zručnosťou. Typická eukaryotická bunka môže obsahovať tisíce rôznych proteínov, niektoré sú veľmi bohaté a niektoré obsahujú len niekoľko kópií. S cieľom študovať určitéproteín, je potrebné najprv vyčistiť proteín od iných proteínov a neproteínových molekúl.

1. Metóda vysolovaniaproteín:

Neutrálna soľ má významný vplyv na rozpustnosť bielkovín. Všeobecne platí, že so zvyšujúcou sa koncentráciou soli pri nízkej koncentrácii soli sa zvyšuje rozpustnosť proteínu. Toto sa nazýva solenie; keď sa koncentrácia soli naďalej zvyšuje, Rozpustnosť proteínu v rôznej miere klesá a oddeľuje sa jeden po druhom. Tento jav sa nazýva vysolenie.

2. Metóda stohovania izoelektrických bodov:

Elektrostatické odpudzovanie medzi časticami je najmenšie, keď je proteín statický, takže aj rozpustnosť je najmenšia. Izoelektrické body rôznych proteínov sú rôzne. pH kondicionačného roztoku sa môže použiť na dosiahnutie izoelektrického bodu proteínu, aby sa akumuloval, ale táto metóda sa zriedka používa samostatne a možno ju kombinovať s metódou vysolovania.

3. Dialýza a ultrafiltrácia:

Dialýza využíva semipermeabilnú membránu na oddelenie proteínov rôznych veľkostí molekúl. Metóda ultrafiltrácie využíva vysoký tlak alebo odstredivú silu, aby voda a iné malé molekuly rozpustenej látky prešli cez polopriepustnú membránu, pričomproteínzostáva na membráne. Môžete si vybrať rôzne veľkosti pórov na zachytenie proteínov s rôznymi molekulovými hmotnosťami.

4. Metóda gélovej filtrácie:

Tiež nazývaná veľkostná vylučovacia chromatografia alebo chromatografia s molekulovým sitom, je to jedna z najužitočnejších metód na separáciu proteínových zmesí podľa veľkosti molekuly. Bežnejšie používané výplňové materiály v kolóne sú glukózový gél (Sephadex ged) a agarózový gél (agarózový gél).

5. Elektroforéza:

Za rovnakých podmienok pH môžu byť oddelené rôzne proteíny v dôsledku ich rôznych molekulových hmotností a rôznych nábojov v elektrickom poli. Stojí za to venovať pozornosť izoelektrickej elektroforéze, ktorá ako nosič používa amfolyt. Počas elektroforézy amfolyt vytvára gradient pH, ktorý sa postupne pridáva od kladnej elektródy k zápornej elektróde. Keď v ňom bielkovina s určitým nábojom pláva, dostane sa k sebe. Poloha pH elektrického bodu je nespojitá a túto metódu možno použiť na analýzu a prípravu rôznych proteínov.

6. Iónová komunikačná chromatografia:

iónové komunikačné činidlá zahŕňajú katiónové komunikačné činidlá (ako je karboxymetylcelulóza; CM-celulóza) a aniónové komunikačné činidlá (dietylaminoetylcelulóza). Pri prechode cez iónovú komunikačnú chromatografickú kolónu sa proteín s opačným nábojom ako má iónová komunikačná látka adsorbuje na iónovej komunikačnej činidle a potom sa adsorbujeproteínsa eluuje zmenou pH alebo iónovej sily.

7. Afinitná chromatografia:

Afinitná chromatografia je mimoriadne užitočná metóda na separáciu proteínov. Často vyžaduje iba jeden krok na oddelenie určitého proteínu, ktorý sa má purifikovať, od špinavej proteínovej zmesi s vysokou čistotou.

Táto metóda je založená skôr na špecifickej než kovalentnej väzbe určitých proteínov na inú molekulu nazývanú ligand (Ligand).

Základný princíp:

proteíny existujú v špinavej zmesi v tkanivách alebo bunkách a každý typ bunky obsahuje tisíce rôznych proteínov. Preto je rozlíšenie medzi proteínmi dôležitou súčasťou biochémie a nebolo to jediné. Alebo súbor hotových metód môže odstrániť akýkoľvek druh proteínu z chaotického zmiešaného proteínu, takže sa často používa niekoľko metód v kombinácii.