PCR FAQ 1. Falošne negatívny, neobjaví sa žiadny amplifikačný pás 2. Falošný pozitívny 3. Objavia sa nešpecifické amplifikačné pásy 4. Objavia sa šupinaté ťahacie prúžky alebo rozmazané prúžky：

1Falošne negatívny, neobjaví sa žiadny zosilnený pás Kľúčovými aspektmi reakcie PCR sú

① príprava templátovej nukleovej kyseliny

② kvalita a špecifickosť primeru

③ kvalita enzýmov a

④ Podmienky cyklu PCR. Ak chcete nájsť dôvody, analýza a výskum by sa mali vykonať aj na vyššie uvedených odkazoch.

Šablóna:

① Šablóna obsahuje bielkoviny nečistôt

② Šablóna obsahuje inhibítory enzýmu Taq

③ Proteíny v šablóne nie sú štiepené a odstránené, najmä históny v chromozómoch

④ Počas extrakcie a prípravy šablóny sa stratilo príliš veľa alebo sa vdýchol fenol

⑤ Šablónová nukleová kyselina nie je úplne denaturovaná. Keď je kvalita enzýmov a primérov dobrá, ak sa nezobrazia amplifikačné pásy, je najpravdepodobnejšie, že niečo nie je v poriadku s procesom trávenia vzorky alebo procesom extrakcie templátovej nukleovej kyseliny. Preto musí byť pripravený účinný a stabilný roztok trávenia a postup by mal byť pevne stanovený a nemal by sa ľubovoľne meniť. . Inaktivácia enzýmov: Je potrebné nahradiť nový enzým, alebo použiť súčasne staré aj nové enzýmy na analýzu, či falošné negatívy nie sú spôsobené stratou alebo nedostatočnou aktivitou enzýmu. Treba poznamenať, že niekedy sa zabúda na enzým Taq. Priméry: Kvalita primérov, koncentrácia primérov a to, či sú koncentrácie dvoch primérov symetrické, sú bežné dôvody zlyhania PCR alebo neuspokojivé amplifikačné pásy a ľahká difúzia. V niektorých dávkach sú problémy s kvalitou syntézy primérov. Jeden z dvoch primérov má vysokú koncentráciu a druhý má nízku koncentráciu, čo vedie k asymetrickej amplifikácii s nízkou účinnosťou.

Protiopatrenia sú:

① Vyberte si dobrú jednotku na syntézu primeru.

② Koncentrácia primérov by sa nemala pozerať len na hodnotu OD, ale mala by venovať pozornosť aj zásobnému roztoku primérov pre elektroforézu na agarózovom géli. Musia tam byť primerové prúžky a jas dvoch primerov by mal byť približne rovnaký. Napríklad jeden primer má pás a druhý primer nemá pás. Pri prúžkoch môže v tomto čase PCR zlyhať a mala by sa vyriešiť dohodou s jednotkou na syntézu primérov. Ak má jeden základný náter vysoký jas a druhý nízky jas, vyrovnajte koncentrácie pri riedení základov.

③ Priméry by sa mali skladovať vo vysokej koncentrácii a malých množstvách, aby sa predišlo opakovanému zmrazovaniu a rozmrazovaniu alebo dlhodobému skladovaniu v chladničke, čo môže viesť k znehodnoteniu a znehodnoteniu primerov.

④Konštrukcia priméru je nerozumná, napríklad dĺžka priméru nie je dostatočná, medzi primérmi sa tvoria diméry atď. Koncentrácia Mg2+: Koncentrácia iónov Mg2+ má veľký vplyv na účinnosť amplifikácie PCR. Ak je koncentrácia príliš vysoká, môže znížiť špecificitu PCR amplifikácie. Ak je koncentrácia príliš nízka, ovplyvní to výťažok amplifikácie PCR a dokonca spôsobí zlyhanie amplifikácie PCR bez amplifikačných pásov. Zmeny v reakčnom objeme: Obvykle sú objemy používané na PCR amplifikáciu 20 ul, 30 ul a 50 ul. Alebo 100 ul, aký objem by sa mal použiť na amplifikáciu PCR, sa nastavuje podľa rôznych účelov vedeckého výskumu a klinického testovania. Po vytvorení malého objemu, napríklad 20 ul, a následnom vytvorení väčšieho objemu, musíte dodržiavať podmienky, inak ľahko zlyhá. Fyzikálne dôvody: Denaturácia je veľmi dôležitá pre PCR amplifikáciu. Ak je teplota denaturácie nízka a čas denaturácie krátky, je veľmi pravdepodobné, že dôjde k falošným negatívam; teplota žíhania je príliš nízka, čo môže spôsobiť nešpecifickú amplifikáciu a znížiť špecifickú účinnosť amplifikácie. Teplota žíhania je príliš vysoká. Vysoko ovplyvňuje väzbu primérov na templáty a znižuje účinnosť amplifikácie PCR. Niekedy je potrebné použiť bežný teplomer na kontrolu teploty denaturácie, žíhania a predlžovania v zosilňovači alebo vo vode rozpustnej nádobe. To je tiež jeden z dôvodov zlyhania PCR. Variácia cieľovej sekvencie: Ak je cieľová sekvencia zmutovaná alebo deletovaná, čo ovplyvňuje špecifickú väzbu priméru na templát, alebo primér a templát stratia komplementárnu sekvenciu v dôsledku delécie určitého segmentu cieľovej sekvencie, PCR amplifikácia nebude úspešný.

2. Falošne pozitívny Pruh amplifikácie PCR, ktorý sa objaví, je konzistentný s pruhom cieľovej sekvencie a niekedy je pruh usporiadanejší a jasnejší. Nevhodný návrh priméru: Vybraná amplifikačná sekvencia má homológiu s necieľovou amplifikačnou sekvenciou, takže pri vykonávaní PCR amplifikácie je amplifikovaný PCR produkt necieľovou sekvenciou. Ak je cieľová sekvencia príliš krátka alebo primér je príliš krátky, môže ľahko dôjsť k falošným pozitívam. Priméry je potrebné prerobiť. Krížová kontaminácia cieľových sekvencií alebo amplifikačných produktov: Existujú dva dôvody pre túto kontamináciu: Po prvé, krížová kontaminácia celého genómu alebo veľkých fragmentov, čo vedie k falošne pozitívnym výsledkom. Tento falošne pozitívny výsledok je možné vyriešiť nasledujúcimi metódami: Pri prevádzke buďte opatrní a opatrní, aby ste zabránili nasatiu cieľovej sekvencie do pištole na vzorky alebo vystriekaniu z centrifugačnej skúmavky. Okrem enzýmov a látok, ktoré neznesú vysoké teploty, by sa všetky činidlá alebo zariadenia mali sterilizovať vysokým tlakom. Všetky centrifugačné skúmavky a špičky pipiet na vstrekovanie vzoriek by sa mali použiť raz. Ak je to potrebné, pred pridaním vzorky sa reakčné skúmavky a činidlá ožiaria ultrafialovým svetlom, aby sa zničili prítomné nukleové kyseliny. Druhým je kontaminácia malých fragmentov nukleových kyselín vo vzduchu. Tieto malé fragmenty sú kratšie ako cieľová sekvencia, ale majú určitú homológiu. Môžu byť navzájom spojené a po komplementárnosti s primérmi môžu byť produkty PCR amplifikované, čo vedie k falošne pozitívnym výsledkom, ktoré možno znížiť alebo eliminovať metódami nested PCR.

 

3. Objavia sa nešpecifické amplifikačné pásy Pásy, ktoré sa objavia po PCR amplifikácii, nie sú v súlade s očakávanou veľkosťou, buď väčšie alebo menšie, alebo sa súčasne objavia špecifické amplifikačné pásy aj nešpecifické amplifikačné pásy. Dôvody pre výskyt nešpecifických pásov sú: po prvé, priméry nie sú úplne komplementárne k cieľovej sekvencii alebo priméry agregujú za vzniku dimérov. Druhým dôvodom je, že koncentrácia Mg2+ iónov je príliš vysoká, teplota žíhania je príliš nízka a počet cyklov PCR je príliš vysoký. Druhým faktorom je kvalita a množstvo enzýmu. Enzýmy z niektorých zdrojov sú často náchylné na nešpecifické pásy, ale enzýmy z iných zdrojov nie. Nadmerné množstvo enzýmov môže niekedy viesť k nešpecifickej amplifikácii. Protiopatrenia zahŕňajú: v prípade potreby prepracovanie základných náterov. Znížte množstvo enzýmu alebo ho nahraďte iným zdrojom. Znížte množstvo primérov, primerane zvýšte množstvo templátu a znížte počet cyklov. Teplotu žíhania primerane zvýšte alebo použite metódu dvoch teplôt (denaturácia pri 93°C, žíhanie a predlžovanie okolo 65°C).

 

4. Objaví sa šupinatý ťah alebo šmuhy Amplifikácia PCR sa niekedy javí ako rozmazané pásy, pásy podobné listom alebo pásy podobné kobercom. Príčinou je často príliš veľa enzýmu alebo nízka kvalita enzýmu, príliš vysoká koncentrácia dNTP, príliš vysoká koncentrácia Mg2+, príliš nízka teplota žíhania a príliš veľa cyklov. Protiopatrenia zahŕňajú: ① Znížte množstvo enzýmu alebo nahraďte enzým iným zdrojom. ②Znížte koncentráciu dNTP. Vhodne znížte koncentráciu Mg2+. Zvýšte množstvo šablón a znížte počet cyklov