Разделение и очистка белков широко используются в биохимических исследованиях и приложениях и являются важным оперативным навыком. Типичная эукариотическая клетка может содержать тысячи различных белков, некоторые из которых очень богаты, а некоторые содержат всего несколько копий. Чтобы изучить определенныйбелок, необходимо предварительно очистить белок от других белков и небелковых молекул.

1. Метод высаливаниябелок:

Нейтральная соль оказывает существенное влияние на растворимость белка. Обычно с увеличением концентрации соли при низкой концентрации растворимость белка увеличивается. Это называется солением; когда концентрация соли продолжает увеличиваться, растворимость белка снижается в разной степени и выделяется один за другим. Это явление называется высаливанием.

2. Метод наложения изоэлектрических точек:

Электростатическое отталкивание между частицами наименьшее, когда белок статичен, поэтому растворимость также наименьшая. Изоэлектрические точки различных белков различны. pH кондиционирующего раствора можно использовать для достижения изоэлектрической точки белка, вызывая его накопление, но этот метод редко используется отдельно и может сочетаться с методом высаливания.

3.Диализ и ультрафильтрация:

В диализе используется полупроницаемая мембрана для разделения белков разного размера молекул. Метод ультрафильтрации использует высокое давление или центробежную силу, чтобы заставить воду и другие небольшие молекулы растворенных веществ проходить через полупроницаемую мембрану, в то время какбелокостается на мембране. Вы можете выбрать разные размеры пор для перехвата белков с разной молекулярной массой.

4. Метод гелевой фильтрации:

Это также называемый эксклюзионной хроматографией или молекулярно-ситовой хроматографией. Это один из наиболее полезных методов разделения белковых смесей в зависимости от размера молекул. Наиболее часто используемыми насадочными материалами в колонке являются гель глюкозы (сефадекс-гед) и агарозный гель (агарозный гель).

5. Электрофорез:

При одном и том же уровне pH различные белки могут быть разделены благодаря их разной молекулярной массе и разным зарядам в электрическом поле. Стоит обратить внимание на изоэлектрический электрофорез, в котором в качестве носителя используется амфолит. Во время электрофореза амфолит образует градиент pH, постепенно добавляемый от положительного электрода к отрицательному. Когда в нем плавает белок с определенным зарядом, они достигают друг друга. Положение электрической точки по pH является прерывистым, и этот метод можно использовать для анализа и приготовления различных белков.

6.Ионно-коммуникационная хроматография:

Агенты ионной связи включают катионные агенты связи (такие как карбоксиметилцеллюлоза; CM-целлюлоза) и анионные агенты связи (диэтиламиноэтилцеллюлоза). При прохождении через колонку ионно-связывающей хроматографии белок с зарядом, противоположным агенту ионной связи, адсорбируется на агенте ионной связи, а затем адсорбированныйбелокэлюируется путем изменения pH или ионной силы.

7.Аффинная хроматография:

Аффинная хроматография — чрезвычайно полезный метод разделения белков. Часто требуется всего один шаг, чтобы отделить определенный белок, подлежащий очистке, от беспорядочной белковой смеси высокой чистоты.

Этот метод основан на специфическом, а не ковалентном связывании определенных белков с другой молекулой, называемой лигандом (Ligand).

Основной принцип:

Белки существуют в беспорядочной смеси в тканях и клетках, и каждый тип клеток содержит тысячи различных белков. Таким образом, различие между белками является важной частью биохимии, и не только ею. Либо набор готовых методов позволяет удалить любой вид белка из беспорядочной смешанной белковой смеси, поэтому часто используют несколько методов в сочетании.