Часто задаваемые вопросы по ПЦР 1. Ложноотрицательный результат, полоса амплификации не появляется 2. Ложноположительный результат 3. Появляются неспецифические полосы амплификации 4. Появляются шелушащиеся полоски или мазки:

1Ложноотрицательный, амплифицированная полоса не появляется. Ключевые аспекты реакции ПЦР:

① приготовление матричной нуклеиновой кислоты

② качество и специфичность праймера

③ качество ферментов и

④ Условия цикла ПЦР. Для выяснения причин также следует провести анализ и исследование по указанным выше ссылкам.

Шаблон:

① Матрица содержит примесные белки.

② Шаблон содержит ингибиторы фермента Taq.

③ Белки матрицы не перевариваются и не удаляются, особенно гистоны в хромосомах.

④ Слишком много было потеряно во время извлечения и подготовки шаблона или вдыхался фенол.

⑤Матричная нуклеиновая кислота не полностью денатурирована. Если качество ферментов и праймеров хорошее, а полосы амплификации не появляются, скорее всего, что-то не так с процессом расщепления образца или процессом экстракции матричной нуклеиновой кислоты. Следовательно, необходимо приготовить эффективный и стабильный раствор для пищеварения, а процедуру следует зафиксировать и не изменять по своему желанию. . Инактивация фермента: необходимо заменить новый фермент или использовать одновременно старые и новые ферменты, чтобы проанализировать, вызваны ли ложноотрицательные результаты потерей или недостаточной активностью фермента. Следует отметить, что иногда о ферменте Taq забывают. Праймеры: Качество праймера, концентрация праймера и симметричность концентраций двух праймеров являются частыми причинами неудач ПЦР или неудовлетворительных полос амплификации и легкой диффузии. В некоторых партиях имеются проблемы с качеством синтеза праймеров. Один из двух праймеров имеет высокую концентрацию, а другой — низкую, что приводит к малоэффективной асимметричной амплификации.

Контрмеры:

① Выберите хорошую установку для синтеза праймеров.

② При концентрации праймеров следует учитывать не только значение ОП, но и обращать внимание на исходный раствор праймера для электрофореза в агарозном геле. Должны быть полосы праймера, и яркость двух полос праймера должна быть примерно одинаковой. Например, у одного праймера есть полоса, а у другого нет полосы. Что касается стрипов, ПЦР на этом этапе может оказаться неудачной, и этот вопрос следует решать путем переговоров с отделом синтеза праймеров. Если один праймер имеет высокую яркость, а другой — низкую, сбалансируйте концентрации при разбавлении праймеров.

③ Праймеры следует хранить в высокой концентрации и в небольших количествах во избежание повторного замораживания и оттаивания или длительного хранения в холодильнике, что может привести к порче и деградации праймеров.

④Необоснованная конструкция праймера, например, длина праймера недостаточна, между праймерами образуются димеры и т. д. Концентрация Mg2+: концентрация ионов Mg2+ оказывает большое влияние на эффективность ПЦР-амплификации. Если концентрация слишком высока, это может снизить специфичность ПЦР-амплификации. Если концентрация слишком низкая, это повлияет на выход ПЦР-амплификации и даже приведет к сбою ПЦР-амплификации без амплификации полос. Изменения объема реакции: Обычно для ПЦР-амплификации используются объемы 20 мкл, 30 мкл и 50 мкл. Или 100 мкл: какой объем следует использовать для ПЦР-амплификации, устанавливается в зависимости от различных целей научных исследований и клинических испытаний. Сделав небольшой объем, например 20ул, а затем сделав больший объем, необходимо соблюдать условия, иначе он легко выйдет из строя. Физические причины: Денатурация очень важна для амплификации ПЦР. Если температура денатурации низкая и время денатурации короткое, весьма вероятно появление ложноотрицательных результатов; температура отжига слишком низкая, что может вызвать неспецифическую амплификацию и снизить удельную эффективность амплификации. Температура отжига слишком высока. Сильно влияет на связывание праймеров с матрицами и снижает эффективность ПЦР-амплификации. Иногда необходимо использовать стандартный термометр для проверки температур денатурации, отжига и удлинения в усилителе или водорастворимом сосуде. Это также одна из причин неудачи ПЦР. Вариация целевой последовательности: если целевая последовательность мутирована или удалена, что влияет на специфическое связывание праймера с матрицей, или праймер и матрица теряют комплементарную последовательность из-за делеции определенного сегмента целевой последовательности, ПЦР-амплификация не будет успешным.

2. ложное срабатывание. Появляющаяся полоса амплификации ПЦР соответствует полосе целевой последовательности, а иногда полоса более упорядочена и ярче. Неподходящий дизайн праймера: выбранная последовательность амплификации имеет гомологию с нецелевой последовательностью амплификации, поэтому при выполнении ПЦР-амплификации амплифицированный продукт ПЦР представляет собой нецелевую последовательность. Если целевая последовательность слишком коротка или праймер слишком короткий, легко могут возникнуть ложноположительные результаты. Праймеры необходимо переработать. Перекрестное загрязнение целевых последовательностей или продуктов амплификации. Существует две причины такого загрязнения: во-первых, перекрестное загрязнение всего генома или его больших фрагментов, приводящее к ложноположительным результатам. Эту ложноположительную ситуацию можно устранить следующими методами: Будьте осторожны и осторожны при работе, чтобы не допустить всасывания целевой последовательности в пистолет для проб или выплескивания из центрифужной пробирки. За исключением ферментов и веществ, не выдерживающих высоких температур, все реагенты и оборудование следует стерилизовать под высоким давлением. Все центрифужные пробирки и наконечники пипеток для ввода проб следует использовать один раз. При необходимости реакционные пробирки и реагенты перед добавлением образца облучаются ультрафиолетовым светом для разрушения присутствующих нуклеиновых кислот. Второй – загрязнение воздуха мелкими фрагментами нуклеиновых кислот. Эти небольшие фрагменты короче целевой последовательности, но имеют определенную гомологию. Их можно сращивать друг с другом, и после того, как они дополняют праймеры, продукты ПЦР могут амплифицироваться, что приводит к ложноположительным результатам, которые можно уменьшить или устранить с помощью вложенных методов ПЦР.

 

3. Появляются полосы неспецифической амплификации. Полосы, появляющиеся после ПЦР-амплификации, не соответствуют ожидаемому размеру, либо больше, либо меньше, или одновременно появляются как специфические полосы амплификации, так и неспецифические полосы амплификации. Причинами появления неспецифических полос являются: во-первых, праймеры не полностью комплементарны целевой последовательности или праймеры агрегируют с образованием димеров. Вторая причина заключается в слишком высокой концентрации ионов Mg2+, слишком низкой температуре отжига и слишком большом количестве циклов ПЦР. Вторым фактором является качество и количество фермента. Ферменты из некоторых источников часто склонны к образованию неспецифических полос, а ферменты из других источников - нет. Чрезмерное количество ферментов иногда может привести к неспецифической амплификации. Контрмеры включают в себя: при необходимости изменить дизайн праймеров. Уменьшите количество фермента или замените его другим источником. Уменьшите количество праймеров, соответствующим образом увеличьте количество матрицы и уменьшите количество циклов. Соответствующим образом увеличьте температуру отжига или используйте метод двух температурных точек (денатурация при 93°C, отжиг и удлинение около 65°C).

 

4. Появляются шелушащиеся пятна или мазки. ПЦР-амплификация иногда проявляется в виде размазанных полос, листовидных полос или ковровых полос. Причины часто вызваны слишком большим количеством фермента или плохим качеством фермента, слишком высокой концентрацией dNTP, слишком высокой концентрацией Mg2+, слишком низкой температурой отжига и слишком большим количеством циклов. Контрмеры включают: ① Уменьшите количество фермента или замените фермент другим источником. ②Уменьшите концентрацию dNTP. Соответствующим образом уменьшите концентрацию Mg2+. Увеличьте количество шаблонов и уменьшите количество циклов.