د PCR FAQ 1. غلط منفي، هیڅ امپلیفیکیشن بانډ نه ښکاري 2. غلط مثبت 3. غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه څرګندیږي 4. فلکي ډریګ سټریپونه یا سمیر سټیپونه څرګندیږي:

1 غلط منفي، هیڅ پراخ شوی بانډ نه ښکاري د PCR غبرګون کلیدي اړخونه دي

① د کینډی نیوکلیک اسید چمتو کول

② پریمر کیفیت او ځانګړتیا

③ انزایم کیفیت او

④ د PCR دورې شرایط. د دلایلو د موندلو لپاره باید په پورتنیو لینکونو کې هم شننه او څیړنه وشي.

کينډۍ:

① په نمونه کې ناپاک پروټینونه شامل دي

② دا نمونه د Taq انزایم مخنیوی کونکي لري

③ په کینډۍ کې پروټینونه نه هضم کیږي او له مینځه وړل کیږي، په ځانګړې توګه په کروموزوم کې هسټونونه

④ د نمونې د استخراج او چمتو کولو په جریان کې خورا ډیر ضایع شوی، یا فینول تنفس شوی

⑤کینډۍ نیوکلییک اسید په بشپړه توګه له مینځه وړل شوی نه دی. کله چې د انزایمونو او پرائمر کیفیت ښه وي، که د امپلیفیکیشن بانډونه څرګند نه وي، نو ډیر احتمال شته چې د نمونې د هضم پروسې یا ټیمپلیټ نیوکلیک اسید استخراج پروسې کې یو څه غلط وي. له همدې امله، د هضم یو اغیزمن او باثباته حل باید چمتو شي، او طرزالعمل باید ثابت شي او باید په خپله خوښه بدل نشي. . د انزایمونو غیرفعالیت: دا اړینه ده چې نوي انزایمونه ځای په ځای کړئ ، یا په ورته وخت کې دواړه زاړه او نوي انزایمونه وکاروئ ترڅو دا تحلیل کړئ چې ایا غلط منفي د انزایمونو د ضایع کیدو یا ناکافي فعالیت له امله رامینځته شوي. دا باید په پام کې ونیول شي چې ځینې وختونه د تاق انزایم هیر شوی وي. پرائمر: د پرائمر کیفیت، د پریمر غلظت، او آیا د دوه پرائمر غلظت همغږي دي د PCR د ناکامۍ یا غیر اطمیناني امپلیفیکیشن بندونو او اسانه خپریدو عام لاملونه دي. په ځینو بستونو کې د پریمر ترکیب کیفیت سره ستونزې شتون لري. د دوو پرائمرونو څخه یو یې لوړ غلظت لري او بل یې ټیټ غلظت لري، چې په پایله کې د ټیټ موثریت غیر متناسب امپلیفیکیشن دی.

د مخنیوي تدابیر دا دي:

① یو ښه پریمر ترکیب واحد وټاکئ.

② د پریمر غلظت باید نه یوازې د OD ارزښت ته وګوري ، بلکه د اګرز جیل الیکٹروفورسیس لپاره د پریمر سټاک محلول ته هم پاملرنه وکړي. د پریمر بانډونه باید شتون ولري، او د دوه پریمر بډونو روښانتیا باید تقریبا ورته وي. د مثال په توګه، یو پریمر یو بانډ لري او بل پریمر هیڅ بانډ نلري. د پټو لپاره، PCR ممکن پدې وخت کې ناکام شي او باید د پریمر ترکیب واحد سره د خبرو اترو له لارې حل شي. که یو پریمر لوړ روښانتیا ولري او بل ټیټ روښانتیا ولري، د پریمرونو د کمولو په وخت کې غلظت توازن کړئ.

③ پرائمرونه باید په ډیر غلظت او لږ مقدار کې زیرمه شي ترڅو د بار بار یخیدو او پړسیدو مخه ونیول شي یا په یخچال کې د اوږدې مودې ذخیره کول ممکن د پریمرونو د خرابیدو او تخریب لامل شي.

④د پرائمر ډیزاین غیر معقول دی، لکه د پریمر اوږدوالی کافي نه دی، ډیمرونه د پریمرونو ترمنځ جوړیږي، او داسې نور. د Mg2+ غلظت: د Mg2+ آیون غلظت د PCR امپلیفیکیشن موثریت باندې لوی تاثیر لري. که چیرې غلظت خورا لوړ وي ، نو دا کولی شي د PCR امپلیفیکیشن ځانګړتیا کمه کړي. که چیرې غلظت خورا ټیټ وي ، نو دا به د PCR امپلیفیکیشن حاصل اغیزه وکړي او حتی د دې لامل شي چې د PCR امپلیفیکیشن د بډونو پراخولو پرته ناکام شي. د عکس العمل حجم کې بدلونونه: معمولا د PCR امپلیفیکیشن لپاره کارول شوي حجمونه 20ul، 30ul، او 50ul دي. یا 100ul، کوم حجم باید د PCR امپلیفیکیشن لپاره وکارول شي د ساینسي څیړنو او کلینیکي ازموینې مختلف اهدافو سره سم تنظیم شوي. د کوچني حجم جوړولو وروسته، لکه 20ul، او بیا لوی حجم جوړ کړئ، تاسو باید شرایط تعقیب کړئ، که نه نو دا به په اسانۍ سره ناکام شي. فزیکي لاملونه: د PCR د لوړولو لپاره د ډینیچریشن خورا مهم دی. که چیرې د تودوخې تودوخه ټیټه وي او د تخریب وخت لنډ وي، د غلط منفي پیښو احتمال ډیر دی؛ د annealing تودوخه خورا ټیټه ده، کوم چې کولی شي د غیر مشخص پراخوالي لامل شي او د ځانګړي امپلیفیکیشن موثریت کم کړي. د انیل کولو تودوخه خورا لوړه ده. ټیمپلیټونو ته د پریمرونو پابندۍ خورا ډیر تاثیر کوي او د PCR امپلیفیکیشن موثریت کموي. ځینې ​​​​وختونه دا اړینه ده چې یو معیاري ترمامیتر وکاروئ ترڅو په امپلیفیر یا په اوبو کې محلول شوي کڅوړه کې د ډینیټوریشن ، اینیلینګ او تودوخې تودوخې معاینه کړئ. دا هم د PCR د ناکامۍ یو لامل دی. د هدف ترتیب تغیر: که چیرې د هدف ترتیب بدل شوی یا حذف شي ، کوم چې د ټیمپلیټ سره د پریمر ځانګړي پابند اغیزه کوي ، یا پریمر او ټیمپلیټ د هدف ترتیب د یوې ټاکلې برخې د حذف کیدو له امله تکمیلي ترتیب له لاسه ورکوي ، د PCR امپلیفیکیشن بریالي به نشي.

2. غلط مثبت د PCR امپلیفیکیشن بانډ چې ښکاري د هدف ترتیب بانډ سره مطابقت لري، او ځینې وختونه دا بانډ ډیر منظم او روښانه وي. نامناسب پرائمر ډیزاین: ټاکل شوې امپلیفیکیشن سلسله د غیر هدف امپلیفیکیشن ترتیب سره هومولوژي لري ، نو کله چې د PCR امپلیفیکیشن ترسره کوي ، د PCR امپلیفیکیشن محصول یو غیر هدف ترتیب دی. که د هدف ترتیب ډیر لنډ وي یا پریمر ډیر لنډ وي، غلط مثبت ممکن په اسانۍ سره واقع شي. پریمر باید بیا ډیزاین شي. د هدف ترتیبونو یا امپلیفیکیشن محصولاتو کراس ککړتیا: د دې ککړتیا دوه لاملونه شتون لري: لومړی د ټول جینوم یا لویو برخو کراس ککړتیا چې د غلط مثبتو لامل کیږي. دا غلط مثبت د لاندې میتودونو په واسطه حل کیدی شي: د کار کولو په وخت کې محتاط او نرم اوسئ ترڅو د هدف ترتیب د نمونې ټوپک کې د چوسیدو یا د سینټرفیوج ټیوب څخه بهر شي. د انزایمونو او موادو پرته چې د لوړې تودوخې سره مقاومت نشي کولی، ټول ریجنټ یا تجهیزات باید د لوړ فشار په واسطه تعقیم شي. ټول سینټرفیوج ټیوبونه او د نمونې انجیکشن پایپټ لارښوونې باید یوځل وکارول شي. که اړتیا وي، د عکس العمل ټیوبونه او ریجنټونه د نمونې اضافه کولو دمخه د الټرا وایلیټ رڼا سره شعاع کیږي ترڅو موجود نیوکلیک اسیدونه له مینځه ویسي. دوهم په هوا کې د نیوکلیک اسیدونو د کوچنیو برخو ککړتیا ده. دا کوچنۍ ټوټې د هدف ترتیب څخه لنډې دي، مګر یو مشخص هومولوژي لري. دوی یو بل ته ویشل کیدی شي، او د پریمرونو بشپړولو وروسته، د PCR محصولات پراخ کیدی شي، په پایله کې غلط مثبت، کوم چې کیدای شي د پی سی آر میتودونو په واسطه کم یا له منځه یوړل شي.

 

3. غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه څرګندیږي هغه بانډونه چې د PCR امپلیفیکیشن وروسته څرګندیږي د تمه شوي اندازې سره متناسب دي ، یا لوی یا کوچني ، یا دواړه ځانګړي امپلیفیکیشن بانډونه او غیر مشخص امپلیفیکیشن بانډونه په ورته وخت کې څرګندیږي. د غیر مشخص بانډونو د څرګندیدو لاملونه په لاندې ډول دي: لومړی، پریمرونه په بشپړ ډول د هدف ترتیب سره بشپړونکي ندي، یا پرائمرونه د ډیمرونو د جوړولو لپاره راټولیږي. دوهم دلیل یې دا دی چې د Mg2+ آیون غلظت خورا لوړ دی ، د انیل کولو تودوخه خورا ټیټه ده ، او د PCR دورې شمیر خورا لوړ دی. دوهم فاکتور د انزایم کیفیت او مقدار دی. د ځینو سرچینو څخه انزایمونه اکثرا د غیر مشخص بانډونو سره مخ دي مګر د نورو سرچینو څخه انزایمونه ندي. د انزایمونو ډیر مقدار ځینې وختونه د غیر مشخص لوړیدو لامل کیدی شي. د مخنیوي اقداماتو کې شامل دي: د اړتیا په صورت کې پریمر بیا ډیزاین کړئ. د انزایم مقدار کم کړئ یا یې د بلې سرچینې سره بدل کړئ. د پریمرونو اندازه کمه کړئ، د نمونې اندازه په مناسبه توګه زیاته کړئ، او د سایکلونو شمیر کم کړئ. د انیل کولو تودوخه په مناسبه توګه لوړه کړئ یا د دوه تودوخې نقطې میتود وکاروئ (په 93 درجې سانتي ګراد کې ډینیټریشن ، انیل کول او د 65 درجې C شاوخوا غزول).

 

4. فلکي ډریګ یا سمیرونه د PCR امپلیفیکیشن ښکاري کله ناکله د مسیر شوي بانډونو ، د شیټ په څیر بندونو یا د غالۍ په څیر بانډونو په څیر ښکاري. لاملونه اکثرا د ډیر انزایمونو یا د انزایمونو ضعیف کیفیت ، ډیر لوړ dNTP غلظت ، ډیر لوړ Mg2 + غلظت ، د انیل کولو تودوخې خورا ټیټ ، او ډیری دورې له امله رامینځته کیږي. د مخنیوي اقداماتو کې شامل دي: ① د انزایم مقدار کم کړئ ، یا د انزایم ځای په بل ځای کې واچوئ. ②د dNTP غلظت کموي. په مناسب ډول د Mg2+ غلظت کم کړئ. د ټیمپلیټ مقدار زیات کړئ او د دورې شمیر کم کړئ