Rozdzielanie i oczyszczanie białek jest szeroko stosowane w badaniach i zastosowaniach biochemicznych i stanowi ważną umiejętność operacyjną. Typowa komórka eukariotyczna może zawierać tysiące różnych białek, niektóre są bardzo bogate, a inne zawierają tylko kilka kopii. Aby studiować pewienbiałko, konieczne jest najpierw oczyszczenie białka z innych białek i cząsteczek niebiałkowych.

1. Metoda wysalaniabiałko:

Sól obojętna ma znaczący wpływ na rozpuszczalność białka. Ogólnie rzecz biorąc, wraz ze wzrostem stężenia soli przy niskim stężeniu soli wzrasta rozpuszczalność białka. Nazywa się to soleniem; gdy stężenie soli stale rośnie, rozpuszczalność białek zmniejsza się w różnym stopniu i oddziela się jedno po drugim. Zjawisko to nazywa się wysalaniem.

2. Metoda układania punktów izoelektrycznych:

Odpychanie elektrostatyczne między cząsteczkami jest najmniejsze, gdy białko jest statyczne, więc rozpuszczalność jest również najmniejsza. Punkty izoelektryczne różnych białek są różne. pH roztworu kondycjonującego można wykorzystać do osiągnięcia punktu izoelektrycznego białka. Należy je kumulować, ale metoda ta jest rzadko stosowana samodzielnie i można ją połączyć z metodą wysalania.

3.Dializa i ultrafiltracja:

Dializa wykorzystuje półprzepuszczalną membranę do oddzielania białek o różnej wielkości cząsteczek. Metoda ultrafiltracji wykorzystuje wysokie ciśnienie lub siłę odśrodkową, aby woda i inne małe cząsteczki substancji rozpuszczonych przedostały się przez półprzepuszczalną membranę, podczas gdybiałkopozostaje na membranie. Można wybrać różne rozmiary porów, aby przechwycić białka o różnych masach cząsteczkowych.

4. Metoda filtracji żelowej:

Zwana także chromatografią wykluczania lub chromatografią na sitach molekularnych, jest to jedna z najbardziej użytecznych metod rozdzielania mieszanin białek według wielkości cząsteczek. Częściej stosowanymi materiałami wypełniającymi kolumnę są żel glukozowy (Sephadex ged) i żel agarozowy (żel agarozowy).

5. Elektroforeza:

W tych samych warunkach pH różne białka można rozdzielić ze względu na ich różne masy cząsteczkowe i różne ładunki w polu elektrycznym. Warto zwrócić uwagę na elektroforezę z zestawem izoelektrycznym, w której jako nośnik wykorzystuje się amfolit. Podczas elektroforezy amfolit tworzy gradient pH dodawany stopniowo od elektrody dodatniej do elektrody ujemnej. Gdy popłynie w nim białko o określonym ładunku, dotrą do siebie. Pozycja pH punktu elektrycznego jest nieciągła i tę metodę można wykorzystać do analizy i przygotowania różnych białek.

6. Chromatografia komunikacyjna jonowa:

środki komunikacyjne jonowe obejmują kationowe środki komunikacyjne (takie jak karboksymetyloceluloza; CM-celuloza) i anionowe środki komunikacyjne (dietyloaminoetyloceluloza). Podczas przechodzenia przez kolumnę chromatograficzną z komunikacją jonową białko o ładunku przeciwnym do środka komunikacji jonowej jest adsorbowane na środku komunikacji jonowej, a następnie zaadsorbowanybiałkojest eluowany poprzez zmianę pH lub siły jonowej.

7. Chromatografia powinowactwa:

Chromatografia powinowactwa jest niezwykle użyteczną metodą rozdzielania białek. Często wystarczy tylko jeden etap, aby oddzielić określone białko do oczyszczenia od niechlujnej mieszaniny białek o wysokiej czystości.

Metoda ta opiera się na specyficznym, a nie kowalencyjnym wiązaniu pewnych białek z inną cząsteczką zwaną ligandem (Ligandem).

Podstawowa zasada:

białka występują w chaotycznej mieszaninie w tkankach lub komórkach, a każdy typ komórki zawiera tysiące różnych białek. Dlatego rozróżnienie między białkami jest ważną częścią biochemii i nie jest jedyną. Lub zestaw gotowych metod może usunąć dowolny rodzaj białka z niechlujnie zmieszanego białka, dlatego często stosuje się kilka metod w połączeniu.