Często zadawane pytania dotyczące PCR 1. Fałszywie ujemny, nie pojawia się żaden prążek amplifikacji 2. Fałszywie dodatni 3. Pojawiają się nieswoiste prążki amplifikacji 4. Pojawiają się łuszczące się paski lub paski rozmazu:
1Fałszywie ujemny, nie pojawia się amplifikowany prążek. Kluczowymi aspektami reakcji PCR są:
① przygotowanie matrycowego kwasu nukleinowego
② jakość i specyficzność podkładu
③ jakość enzymów i
④ Warunki cyklu PCR. Aby znaleźć przyczyny, należy przeprowadzić analizy i badania również na powyższych linkach.
Szablon:
① Szablon zawiera białka zanieczyszczające
② Szablon zawiera inhibitory enzymu Taq
③ Białka w matrycy nie są trawione i usuwane, zwłaszcza histony w chromosomach
④ Podczas ekstrakcji i przygotowania szablonu utracono zbyt dużo lub wdychano fenol
⑤Matrycowy kwas nukleinowy nie jest całkowicie zdenaturowany. Gdy jakość enzymów i starterów jest dobra, jeśli nie pojawiają się prążki amplifikacji, najprawdopodobniej coś jest nie tak z procesem trawienia próbki lub procesem ekstrakcji matrycowego kwasu nukleinowego. Dlatego należy przygotować skuteczny i stabilny roztwór trawiący, a procedurę należy ustalić i nie należy jej dowolnie zmieniać. . Inaktywacja enzymu: konieczna jest wymiana nowego enzymu lub jednoczesne użycie starych i nowych enzymów w celu sprawdzenia, czy fałszywie ujemne wyniki są spowodowane utratą lub niewystarczającą aktywnością enzymu. Należy zauważyć, że czasami zapomina się o enzymie Taq. Startery: Jakość starterów, stężenie starterów oraz to, czy stężenia dwóch starterów są symetryczne, są częstymi przyczynami niepowodzenia reakcji PCR lub niezadowalających pasm amplifikacji i łatwej dyfuzji. W niektórych partiach występują problemy z jakością syntezy starterów. Jeden z dwóch starterów ma wysokie stężenie, a drugi niskie, co skutkuje niską wydajnością asymetrycznej amplifikacji.
Środki zaradcze to:
① Wybierz dobrą jednostkę do syntezy starterów.
② Stężenie starterów powinno uwzględniać nie tylko wartość OD, ale także zwracać uwagę na roztwór podstawowy startera do elektroforezy w żelu agarozowym. Muszą istnieć pasma starterów, a jasność dwóch pasm starterów powinna być mniej więcej taka sama. Na przykład jeden starter ma prążek, a drugi starter nie ma prążka. W przypadku pasków reakcja PCR może w tym momencie zakończyć się niepowodzeniem i należy ją rozwiązać w drodze negocjacji z jednostką syntezy starterów. Jeśli jeden podkład ma wysoką jasność, a drugi niską jasność, należy zbilansować stężenia podczas rozcieńczania podkładów.
③ Podkłady należy przechowywać w dużym stężeniu i małych ilościach, aby zapobiec ponownemu zamarzaniu i rozmrażaniu lub długotrwałemu przechowywaniu w lodówce, co może prowadzić do pogorszenia jakości i degradacji podkładów.
④Projekt startera jest nierozsądny, np. długość startera jest niewystarczająca, pomiędzy starterami tworzą się dimery itp. Stężenie Mg2+: Stężenie jonów Mg2+ ma ogromny wpływ na wydajność amplifikacji PCR. Jeśli stężenie jest zbyt wysokie, może to zmniejszyć specyficzność amplifikacji PCR. Jeśli stężenie jest zbyt niskie, będzie to miało wpływ na wydajność amplifikacji PCR, a nawet spowoduje niepowodzenie amplifikacji PCR bez amplifikacji prążków. Zmiany objętości reakcji: Zwykle objętości stosowane do amplifikacji PCR wynoszą 20 ul, 30 ul i 50 ul. Lub 100ul, jaką objętość należy zastosować do amplifikacji PCR, ustala się zgodnie z różnymi celami badań naukowych i testów klinicznych. Po zrobieniu małej objętości, na przykład 20ul, a następnie zrobieniu większej objętości, musisz przestrzegać warunków, w przeciwnym razie łatwo się nie powiedzie. Powody fizyczne: Denaturacja jest bardzo ważna dla amplifikacji PCR. Jeśli temperatura denaturacji jest niska, a czas denaturacji jest krótki, bardzo prawdopodobne jest wystąpienie fałszywie ujemnych wyników; temperatura wyżarzania jest zbyt niska, co może powodować niespecyficzną amplifikację i zmniejszać specyficzną wydajność amplifikacji. Temperatura wyżarzania jest zbyt wysoka. Silnie wpływa na wiązanie starterów z matrycami i zmniejsza wydajność amplifikacji PCR. Czasami konieczne jest użycie standardowego termometru, aby sprawdzić temperatury denaturacji, wyżarzania i wydłużania we wzmacniaczu lub naczyniu rozpuszczalnym w wodzie. Jest to również jedna z przyczyn niepowodzenia reakcji PCR. Zmienność sekwencji docelowej: Jeżeli sekwencja docelowa jest zmutowana lub usunięta, co wpływa na specyficzne wiązanie startera z matrycą, lub starter i matryca tracą sekwencję komplementarną z powodu usunięcia określonego segmentu sekwencji docelowej, amplifikacja PCR nie odniesie sukcesu.
2.fałszywie pozytywny Pojawiający się prążek amplifikacji PCR jest zgodny z prążkiem sekwencji docelowej, a czasami prążek jest bardziej uporządkowany i jaśniejszy. Niewłaściwy projekt startera: Wybrana sekwencja amplifikacji jest homologiczna z sekwencją amplifikacji inną niż docelowa, zatem podczas przeprowadzania amplifikacji PCR zamplifikowany produkt PCR nie jest sekwencją docelową. Jeśli sekwencja docelowa jest zbyt krótka lub starter jest zbyt krótki, łatwo mogą wystąpić wyniki fałszywie dodatnie. Podkłady należy przeprojektować. Zanieczyszczenie krzyżowe sekwencji docelowych lub produktów amplifikacji: Istnieją dwie przyczyny tego zanieczyszczenia: Po pierwsze, zanieczyszczenie krzyżowe całego genomu lub dużych fragmentów, prowadzące do fałszywie dodatnich wyników. Ten fałszywie pozytywny wynik można rozwiązać następującymi metodami: Podczas obsługi należy zachować ostrożność i delikatność, aby zapobiec zassaniu sekwencji docelowej do pistoletu na próbki lub wypryskaniu z probówki wirówki. Z wyjątkiem enzymów i substancji, które nie są odporne na wysokie temperatury, wszystkie odczynniki i sprzęt należy sterylizować pod wysokim ciśnieniem. Wszystkie probówki wirówkowe i końcówki pipet do wstrzykiwania próbek powinny zostać użyte raz. Jeśli to konieczne, probówki reakcyjne i odczynniki naświetla się światłem ultrafioletowym przed dodaniem próbki w celu zniszczenia obecnych kwasów nukleinowych. Drugim jest zanieczyszczenie powietrza małymi fragmentami kwasów nukleinowych. Te małe fragmenty są krótsze niż sekwencja docelowa, ale wykazują pewną homologię. Można je łączyć ze sobą, a po uzupełnieniu do starterów produkty PCR można amplifikować, co daje wyniki fałszywie dodatnie, które można zmniejszyć lub wyeliminować metodami zagnieżdżonej PCR.
3.Pojawiają się nieswoiste prążki amplifikacji. Prążki, które pojawiają się po amplifikacji PCR, są niezgodne z oczekiwaną wielkością, są większe lub mniejsze, lub jednocześnie pojawiają się zarówno specyficzne prążki amplifikacji, jak i niespecyficzne prążki amplifikacji. Powody pojawienia się nieswoistych prążków są następujące: po pierwsze, startery nie są całkowicie komplementarne do sekwencji docelowej lub startery agregują, tworząc dimery. Drugim powodem jest zbyt wysokie stężenie jonów Mg2+, zbyt niska temperatura renaturacji i zbyt duża liczba cykli PCR. Drugim czynnikiem jest jakość i ilość enzymu. Enzymy z niektórych źródeł są często podatne na niespecyficzne prążki, ale enzymy z innych źródeł nie. Nadmierne ilości enzymów mogą czasami prowadzić do niespecyficznej amplifikacji. Środki zaradcze obejmują: w razie potrzeby przeprojektowanie podkładów. Zmniejsz ilość enzymu lub zastąp go innym źródłem. Zmniejszyć ilość starterów, odpowiednio zwiększyć ilość matrycy i zmniejszyć liczbę cykli. Zwiększ odpowiednio temperaturę wyżarzania lub zastosuj metodę dwupunktową (denaturacja w temperaturze 93°C, wyżarzanie i wydłużanie w temperaturze około 65°C).
4. Pojawiają się łuszczące się smugi lub smugi. Amplifikacja PCR czasami pojawia się w postaci rozmazanych pasm, pasm przypominających arkusze lub prążki przypominające dywan. Przyczyny są często spowodowane zbyt dużą ilością enzymu lub jego złą jakością, zbyt wysokim stężeniem dNTP, zbyt wysokim stężeniem Mg2+, zbyt niską temperaturą wyżarzania i zbyt dużą liczbą cykli. Środki zaradcze obejmują: ① Zmniejsz ilość enzymu lub zastąp enzym innym źródłem. ②Zmniejsz stężenie dNTP. Odpowiednio zmniejszyć stężenie Mg2+. Zwiększ ilość szablonów i zmniejsz liczbę cykli
