PCR FAQ 1. Zonama zabodza, palibe gulu lokulitsa lomwe likuwonekera 2. Zonama zabodza 3. Magulu okulitsa osakhazikika amawonekera 4. Zingwe zokoka kapena zopakapaka zimawonekera:

1 Zoyipa zabodza, palibe gulu lokulitsa lomwe likuwoneka Zofunikira pakuchita kwa PCR ndi

① Kukonzekera kwa template nucleic acid

② mtundu woyambira komanso tsatanetsatane

③ enzyme khalidwe ndi

④ Mayendedwe a PCR. Kuti mupeze zifukwa, kusanthula ndi kufufuza kuyenera kuchitidwanso pamalumikizidwe omwe ali pamwambapa.

Chitsanzo:

① Tsambali lili ndi mapuloteni odetsedwa

② The template ili ndi Taq enzyme inhibitors

③ Mapuloteni omwe ali mu template samagayidwa ndikuchotsedwa, makamaka ma histones mu ma chromosome.

④ Zochulukira zidatayika panthawi yochotsa ndikukonzekera template, kapena phenol idakokedwa.

⑤Nyucleic acid ya template sinasinthidwe kwathunthu. Pamene khalidwe la michere ndi zoyambira ndi zabwino, ngati amplification magulu sakuwoneka, ndizotheka kuti pali chinachake cholakwika ndi chimbudzi ndondomeko ya chitsanzo kapena template nucleic acid m'zigawo ndondomeko. Choncho, njira yabwino komanso yokhazikika ya chimbudzi iyenera kukonzedwa, ndipo ndondomekoyi iyenera kukhazikitsidwa ndipo sayenera kusinthidwa mwakufuna kwake. . Kusagwira ntchito kwa enzyme: M'pofunika kusintha enzyme yatsopano, kapena kugwiritsa ntchito ma enzyme akale ndi atsopano nthawi imodzi kuti muwone ngati zolakwika zabodza zimayambitsidwa ndi kutayika kapena kusakwanira kwa enzyme. Tiyenera kudziwa kuti nthawi zina enzyme ya Taq imayiwalika.Zoyambira: Ubwino woyambira, kukhazikika kwazomwe zimayambira, komanso ngati kuchuluka kwa zoyambira ziwirizo ndi zofananira ndizifukwa zofala za kulephera kwa PCR kapena kukulitsa kosakwanira komanso kufalikira kosavuta. Pali zovuta ndi mtundu wa kaphatikizidwe koyambira m'magulu ena. Chimodzi mwa zoyambira ziwirizi chimakhala ndi ndende yayikulu ndipo china chimakhala chocheperako, zomwe zimapangitsa kuti asymmetric amplification ikhale yocheperako.

Zotsutsana ndi izi:

① Sankhani choyambira chabwino choyambira.

② Kuchuluka kwa zoyambira sikuyenera kungoyang'ana mtengo wa OD, komanso kulabadira njira yoyambira ya agarose gel electrophoresis. Payenera kukhala magulu oyambira, ndipo kuwala kwa magulu awiri oyambira kuyenera kukhala kofanana. Mwachitsanzo, choyambira chimodzi chimakhala ndi gulu ndipo choyambira china chilibe bandi. Kwa mizere, PCR ikhoza kulephera panthawiyi ndipo iyenera kuthetsedwa mwa kukambirana ndi gawo loyambira. Ngati choyambira chimodzi chimakhala chowala kwambiri ndipo chinacho chili ndi kuwala kocheperako, sinthani mozama mukamatsitsa zoyambira.

③ Zoyambira ziyenera kusungidwa mokhazikika komanso pang'ono kuti mupewe kuzizira kobwerezabwereza ndi kusungunuka kapena kusungidwa kwanthawi yayitali mufiriji, zomwe zingayambitse kuwonongeka ndi kuwonongeka kwa zoyambira.

④Mapangidwe oyambira ndi osamveka, monga kutalika kwa primer sikukwanira, ma dimers amapangidwa pakati pa zoyambira, ndi zina zotero. Ngati ndendeyo ndiyokwera kwambiri, imatha kuchepetsa kukhazikika kwa PCR. Ngati ndendeyo ili yotsika kwambiri, ikhudza kukulitsa kwa PCR ndikupangitsa kuti kukulitsa kwa PCR kulephera popanda kukulitsa magulu. Kusintha kwa voliyumu yamachitidwe: Nthawi zambiri ma voliyumu omwe amagwiritsidwa ntchito pakukulitsa kwa PCR ndi 20ul, 30ul, ndi 50ul. Kapena 100ul, voliyumu iti yomwe iyenera kugwiritsidwa ntchito pakukulitsa kwa PCR imayikidwa molingana ndi zolinga zosiyanasiyana za kafukufuku wasayansi ndi kuyezetsa kwachipatala. Pambuyo popanga voliyumu yaying'ono, monga 20ul, ndiyeno kupanga voliyumu yayikulu, muyenera kutsatira zikhalidwe, apo ayi zidzalephera mosavuta. Zifukwa zakuthupi: Kusiyanitsa ndikofunikira kwambiri pakukulitsa kwa PCR. Ngati kutentha kwa denaturation kuli kochepa ndipo nthawi ya denaturation ndi yochepa, zolakwika zabodza zimatha kuchitika; kutentha kwa annealing ndikotsika kwambiri, komwe kungayambitse kukulitsa kosakhazikika ndikuchepetsa kukulitsa kwachangu. Kutentha kwa anneal ndikokwera kwambiri. Zimakhudza kwambiri kumangirira kwa ma templates ndikuchepetsa kukulitsa kwa PCR. Nthawi zina pamafunika kugwiritsa ntchito choyezera choyezera kutentha kuti muwone kutentha kwa denaturation, annealing ndi kuwonjezera kutentha mu amplifier kapena mphika wosungunuka madzi. Ichinso ndi chimodzi mwa zifukwa PCR kulephera. Kusintha kwazomwe mukufuna: Ngati mndandanda wa chandamale wasinthidwa kapena kufufutidwa, zomwe zimakhudza kumangirira kwenikweni kwa choyambira ku template, kapena choyambirira ndi template zimataya kutsatana kophatikizana chifukwa cha kuchotsedwa kwa gawo lina lazotsatira, kukulitsa kwa PCR. sichidzapambana.

2.false positive The PCR amplification bandi yomwe ikuwoneka ikugwirizana ndi ndondomeko ya chandamale, ndipo nthawi zina gululo limakhala ladongosolo komanso lowala kwambiri. Kapangidwe kosayenera koyambira: Kukwezera kosankhidwa kosankhidwa kumakhala ndi ma homology osatsata zomwe mukufuna, ndiye pochita kukulitsa kwa PCR, chopangidwa ndi PCR chokulitsa sichimatsatana. Ngati ndondomeko yomwe mukufuna kutsata ndi yayifupi kwambiri kapena choyambiracho ndi chachifupi kwambiri, zonena zabodza zitha kuchitika mosavuta. Zoyambira ziyenera kukonzedwanso. Kupatsirana kwa njira zotsatizana kapena zokulitsa: Pali zifukwa ziwiri zomwe zimayipitsira izi: Choyamba, kuipitsidwa kwamtundu wonse kapena zidutswa zazikulu, zomwe zimatsogolera ku zabwino zabodza. Chowonadi chabodzachi chingathe kuthetsedwa ndi njira izi: Samalani ndi kufatsa pamene mukugwira ntchito kuti muteteze ndondomeko ya chandamale kuti isalowe mu mfuti yachitsanzo kapena kutulutsa mu chubu cha centrifuge. Kupatula ma enzyme ndi zinthu zomwe sizingathe kupirira kutentha kwakukulu, ma reagents kapena zida zonse ziyenera kutsekedwa ndi kupanikizika kwambiri. Machubu onse a centrifuge ndi malangizo a jekeseni a pipette ayenera kugwiritsidwa ntchito kamodzi. Ngati ndi kotheka, machubu ndi ma reagents amawunikiridwa ndi kuwala kwa ultraviolet musanawonjezepo kuti awononge ma nucleic acid omwe alipo. Chachiwiri ndi kuipitsidwa kwa tiziduswa tating'ono ta nucleic acid mumlengalenga. Tizidutswa tating'onoting'ono timeneti ndi zazifupi kuposa zomwe mukufuna, koma zimakhala ndi ma homology ena. Zitha kuphatikizika kwa wina ndi mzake, ndipo pambuyo pothandizirana ndi zoyambira, zinthu za PCR zimatha kukulitsidwa, zomwe zimapangitsa kuti zikhale zabodza, zomwe zimatha kuchepetsedwa kapena kuthetsedwa ndi njira za PCR.

 

3.Magulu okulitsa omwe sali enieni amawonekera Magulu omwe amawonekera pambuyo pa kukula kwa PCR amatsutsana ndi kukula koyembekezeka, kaya zazikulu kapena zazing'ono, kapena magulu onse okweza ndi osadziwika omwe sali enieni amawonekera nthawi imodzi. Zifukwa zowonekera kwa magulu osadziwika bwino ndi awa: choyamba, zoyambira sizikugwirizana kwathunthu ndi zomwe mukufuna, kapena zoyambira zimaphatikizana kupanga ma dimers. Chifukwa chachiwiri ndikuti kuchuluka kwa ion kwa Mg2 + ndikokwera kwambiri, kutentha kwa annealing ndikotsika kwambiri, ndipo kuchuluka kwa ma PCR ndikokwera kwambiri. Chinthu chachiwiri ndi khalidwe ndi kuchuluka kwa enzyme. Ma enzymes ochokera kuzinthu zina nthawi zambiri amakhala osagwirizana ndi magulu enaake koma ma enzymes ochokera kuzinthu zina satero. Kuchulukirachulukira kwa ma enzymes nthawi zina kumatha kupangitsa kuti pakhale kukulitsa mopanda tanthauzo. Zotsutsana nazo zikuphatikiza: kukonzanso zoyambira ngati kuli kofunikira. Chepetsani kuchuluka kwa enzyme kapena m'malo mwake ndi gwero lina. Chepetsani kuchuluka kwa zoyambira, onjezerani kuchuluka kwa ma template moyenera, ndikuchepetsa kuchuluka kwa mizere. Wonjezerani kutentha kwa annealing moyenerera kapena gwiritsani ntchito njira ya kutentha kwapawiri (denaturation pa 93°C, annealing and extension around 65°C).

 

4.Kukokera kapena smears kumawoneka Kukulitsa kwa PCR nthawi zina kumawoneka ngati ma bandi opaka, ma bandi ngati mapepala kapena magulu ngati kapeti. Zifukwa nthawi zambiri zimayamba chifukwa cha kuchuluka kwa enzyme kapena kuperewera kwa michere, kuchuluka kwa dNTP, kuchuluka kwa Mg2+, kutentha kocheperako, komanso kuzungulira kochulukirapo. Njira zothana nazo ndi izi: ① Chepetsani kuchuluka kwa enzyme, kapena sinthani puloteniyo ndi gwero lina. ②Chepetsani kuchuluka kwa dNTP. Moyenera kuchepetsa ndende ya Mg2 +. Wonjezerani kuchuluka kwa ma templates ndikuchepetsa kuchuluka kwa ma cycle