PCR FAQ 1. Falsk negativ, ingen amplifikasjonsbånd vises 2. Falsk positiv 3. Uspesifikke amplifikasjonsbånd vises 4. Flakete dragstrimler eller smørestrimler vises:

1 Falsk negativ, ingen amplifisert bånd vises. Nøkkelaspektene ved PCR-reaksjonen er

① fremstilling av templatnukleinsyre

② primer kvalitet og spesifisitet

③ enzym kvalitet og

④ PCR-syklusforhold. For å finne årsakene, bør analyser og forskning også utføres på lenkene ovenfor.

Mal:

① Malen inneholder urenhetsproteiner

② Malen inneholder Taq-enzymhemmere

③ Proteinene i malen blir ikke fordøyd og fjernet, spesielt histonene i kromosomene

④ For mye gikk tapt under ekstraksjonen og klargjøringen av malen, eller fenol ble inhalert

⑤ Templatenukleinsyren er ikke fullstendig denaturert. Når kvaliteten på enzymer og primere er god, hvis amplifikasjonsbånd ikke vises, er det mest sannsynlig at det er noe galt med fordøyelsesprosessen til prøven eller templatnukleinsyreekstraksjonsprosessen. Derfor må det utarbeides en effektiv og stabil fordøyelsesløsning, og prosedyren bør fikses og bør ikke endres etter ønske. . Enzyminaktivering: Det er nødvendig å erstatte det nye enzymet, eller bruke både gamle og nye enzymer samtidig for å analysere om falske negativer er forårsaket av tap eller utilstrekkelig enzymaktivitet. Det bør bemerkes at noen ganger glemmes Taq-enzymet. Primere: Primerkvalitet, primerkonsentrasjon og om konsentrasjonene til de to primerne er symmetriske er vanlige årsaker til PCR-svikt eller utilfredsstillende amplifikasjonsbånd og lett diffusjon. Det er problemer med kvaliteten på primersyntese i enkelte partier. En av de to primerne har høy konsentrasjon og den andre har lav konsentrasjon, noe som resulterer i laveffektiv asymmetrisk amplifikasjon.

Mottiltakene er:

① Velg en god primersynteseenhet.

② Konsentrasjonen av primere bør ikke bare se på OD-verdien, men også ta hensyn til primerstamløsningen for agarosegelelektroforese. Det må være primerbånd, og lysstyrken på de to primerbåndene skal være omtrent den samme. For eksempel har en primer et bånd og den andre primeren har ingen bånd. For strimler kan PCR mislykkes på dette tidspunktet og bør løses gjennom forhandling med primersynteseenheten. Hvis en primer har høy lysstyrke og den andre har lav lysstyrke, balanser konsentrasjonene når du fortynner primerne.

③ Primere bør oppbevares i høy konsentrasjon og små mengder for å forhindre gjentatt frysing og tining eller langtidslagring i kjøleskapet, noe som kan føre til forringelse og nedbrytning av primerne.

④Primerdesignet er urimelig, slik som at primerlengden ikke er nok, dimerer dannes mellom primere osv. Mg2+-konsentrasjon: Mg2+-ionekonsentrasjon har stor innflytelse på PCR-amplifikasjonseffektiviteten. Hvis konsentrasjonen er for høy, kan det redusere spesifisiteten til PCR-amplifikasjon. Hvis konsentrasjonen er for lav, vil det påvirke PCR-amplifikasjonsutbyttet og til og med føre til at PCR-amplifikasjonen mislykkes uten amplifiseringsbånd. Endringer i reaksjonsvolum: Vanligvis er volumene som brukes for PCR-amplifikasjon 20 ul, 30 ul og 50 ul. Eller 100ul, hvilket volum som skal brukes til PCR-amplifisering er satt i henhold til ulike formål med vitenskapelig forskning og klinisk testing. Etter å ha laget et lite volum, for eksempel 20ul, og deretter laget et større volum, må du følge betingelsene, ellers vil det lett mislykkes. Fysiske årsaker: Denaturering er svært viktig for PCR-amplifikasjon. Hvis denatureringstemperaturen er lav og denatureringstiden er kort, er det stor sannsynlighet for at falske negativer oppstår; glødetemperaturen er for lav, noe som kan forårsake uspesifikk forsterkning og redusere den spesifikke forsterkningseffektiviteten. Glødetemperaturen er for høy. Påvirker sterkt bindingen av primere til maler og reduserer PCR-amplifikasjonseffektiviteten. Noen ganger er det nødvendig å bruke et standard termometer for å sjekke denaturerings-, utglødnings- og forlengelsestemperaturene i forsterkeren eller den vannløselige potten. Dette er også en av årsakene til PCR-svikt. Målsekvensvariasjon: Hvis målsekvensen er mutert eller deletert, noe som påvirker den spesifikke bindingen av primeren til malen, eller primeren og malen mister den komplementære sekvensen på grunn av sletting av et bestemt segment av målsekvensen, vil PCR-amplifikasjonen vil ikke lykkes.

2.falsk positiv PCR-amplifikasjonsbåndet som vises er i samsvar med målsekvensbåndet, og noen ganger er båndet mer ryddig og lysere. Upassende primerdesign: Den valgte amplifikasjonssekvensen har homologi med ikke-mål-amplifikasjonssekvensen, så når man utfører PCR-amplifikasjon, er det amplifiserte PCR-produktet en ikke-målsekvens. Hvis målsekvensen er for kort eller primeren er for kort, kan det lett oppstå falske positiver. Primere må redesignes. Krysskontaminering av målsekvenser eller amplifikasjonsprodukter: Det er to årsaker til denne kontamineringen: For det første krysskontaminering av hele genomet eller store fragmenter, som fører til falske positiver. Denne falske positive kan løses ved hjelp av følgende metoder: Vær forsiktig og forsiktig når du opererer for å forhindre at målsekvensen blir sugd inn i prøvepistolen eller sprutet ut av sentrifugerøret. Med unntak av enzymer og stoffer som ikke tåler høye temperaturer, bør alle reagenser eller utstyr steriliseres med høyt trykk. Alle sentrifugerør og prøveinjeksjonspipettespisser skal brukes én gang. Om nødvendig blir reaksjonsrørene og reagensene bestrålt med ultrafiolett lys før prøven tilsettes for å ødelegge de tilstedeværende nukleinsyrene. Den andre er forurensning av små fragmenter av nukleinsyrer i luften. Disse små fragmentene er kortere enn målsekvensen, men har en viss homologi. De kan spleises til hverandre, og etter å ha vært komplementære til primerne, kan PCR-produktene amplifiseres, noe som resulterer i falske positive, som kan reduseres eller elimineres ved nestede PCR-metoder.

 

3. Ikke-spesifikke amplifikasjonsbånd vises. Båndene som vises etter PCR-amplifikasjon er inkonsistente med forventet størrelse, enten større eller mindre, eller både spesifikke amplifikasjonsbånd og ikke-spesifikke amplifikasjonsbånd vises samtidig. Årsakene til opptredenen av ikke-spesifikke bånd er: for det første er primerne ikke fullstendig komplementære til målsekvensen, eller primerne aggregerer for å danne dimerer. Den andre grunnen er at Mg2+ ionekonsentrasjonen er for høy, annealingstemperaturen er for lav og antallet PCR-sykluser er for høyt. Den andre faktoren er kvaliteten og kvantiteten av enzymet. Enzymer fra noen kilder er ofte utsatt for uspesifikke bånd, men enzymer fra andre kilder gjør det ikke. For store mengder enzymer kan noen ganger føre til uspesifikk amplifikasjon. Mottiltakene inkluderer: redesign primere om nødvendig. Reduser mengden enzym eller erstatt det med en annen kilde. Reduser mengden primere, øk mengden mal på passende måte, og reduser antall sykluser. Øk annealingstemperaturen på passende måte eller bruk to-temperaturpunktmetoden (denaturering ved 93 °C, annealing og utvidelse rundt 65 °C).

 

4. Flaky drag eller utstryk vises PCR-amplifikasjon vises noen ganger som utsmurte bånd, arklignende bånd eller teppelignende bånd. Årsakene er ofte forårsaket av for mye enzym eller dårlig kvalitet på enzymet, for høy dNTP-konsentrasjon, for høy Mg2+-konsentrasjon, for lav annealingstemperatur og for mange sykluser. Mottiltakene inkluderer: ① Reduser mengden enzym, eller bytt ut enzymet med en annen kilde. ②Reduser konsentrasjonen av dNTP. Reduser Mg2+-konsentrasjonen på passende måte. Øk mengden maler og reduser antall sykluser