प्रोटिनको पृथकीकरण र शुद्धीकरण जैव रसायन अनुसन्धान र अनुप्रयोगमा व्यापक रूपमा प्रयोग गरिन्छ र एक महत्त्वपूर्ण परिचालन कौशल हो। एक सामान्य युकेरियोटिक कोशिकामा हजारौं विभिन्न प्रोटीनहरू हुन सक्छन्, केही धेरै धनी हुन्छन् र केहीमा थोरै प्रतिहरू मात्र हुन्छन्। एक निश्चित अध्ययन गर्न को लागीप्रोटिन, यो पहिले अन्य प्रोटीन र गैर-प्रोटीन अणुहरु बाट प्रोटिन शुद्ध गर्न आवश्यक छ।

1. साल्टिङ-आउट विधिप्रोटिन:

तटस्थ नुनले प्रोटीनको घुलनशीलतामा महत्त्वपूर्ण प्रभाव पार्छ। सामान्यतया, कम नुन एकाग्रता अन्तर्गत नुन एकाग्रता बढ्दै जाँदा, प्रोटिनको घुलनशीलता बढ्छ। यसलाई नमकीन भनिन्छ; जब नुन एकाग्रता बढ्दै जान्छ, प्रोटिनको घुलनशीलता फरक-फरक डिग्रीमा घट्छ र एक पछि अर्को अलग हुन्छ। यो घटनालाई सल्टिङ आउट भनिन्छ।

2. आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दु स्ट्याकिंग विधि:

प्रोटीन स्थिर हुँदा कणहरू बीचको इलेक्ट्रोस्टेटिक प्रतिकर्षण सबैभन्दा सानो हुन्छ, त्यसैले घुलनशीलता पनि सबैभन्दा सानो हुन्छ। विभिन्न प्रोटीनहरूको आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दुहरू फरक हुन्छन्। कन्डिसनिङ समाधानको pH प्रोटिनको आइसोइलेक्ट्रिक बिन्दुमा पुग्न प्रयोग गर्न सकिन्छ, यसलाई जम्मा गर्नुहोस्, तर यो विधि विरलै एक्लै प्रयोग गरिन्छ र नमक-आउट विधिसँग जोड्न सकिन्छ।

3. डायलिसिस र अल्ट्राफिल्ट्रेशन:

डायलिसिसले विभिन्न आणविक आकारका प्रोटिनहरू अलग गर्न अर्ध-पारगम्य झिल्ली प्रयोग गर्दछ। अल्ट्राफिल्ट्रेशन विधिले पानी र अन्य साना घुलनशील अणुहरू अर्ध-पारगम्य झिल्लीबाट पार गर्न उच्च दबाव वा केन्द्रापसारक बल प्रयोग गर्दछ, जबकिप्रोटिनझिल्लीमा रहन्छ। विभिन्न आणविक तौलका प्रोटिनहरू रोक्नको लागि तपाईले विभिन्न छिद्र आकारहरू छनौट गर्न सक्नुहुन्छ।

4. जेल निस्पंदन विधि:

साइज एक्सक्लुजन क्रोमाटोग्राफी वा मोलिक्युलर सिभ क्रोमाटोग्राफी पनि भनिन्छ, यो आणविक साइज अनुसार प्रोटीन मिश्रणहरू अलग गर्ने सबैभन्दा उपयोगी तरिका हो। स्तम्भमा अधिक सामान्य रूपमा प्रयोग हुने प्याकिङ सामग्रीहरू ग्लुकोज जेल (सेफेडेक्स जेड) र एगारोज जेल (एगारोज जेल) हुन्।

5. इलेक्ट्रोफोरेसिस:

एउटै पीएच अवस्था अन्तर्गत, विभिन्न प्रोटीनहरू तिनीहरूको विभिन्न आणविक तौलहरू र विद्युतीय क्षेत्रमा फरक चार्जहरूको कारणले छुट्याउन सकिन्छ। यो आइसोइलेक्ट्रिक सेट इलेक्ट्रोफोरेसिसमा ध्यान दिन लायक छ, जसले एम्फोलाइटलाई वाहकको रूपमा प्रयोग गर्दछ। इलेक्ट्रोफोरेसिसको समयमा, एम्फोलाइटले सकारात्मक इलेक्ट्रोडबाट नकारात्मक इलेक्ट्रोडमा बिस्तारै थपिएको पीएच ढाँचा बनाउँछ। जब एक निश्चित चार्ज भएको प्रोटिन यसमा पौडी खेल्छ, यो एक अर्कामा पुग्छ। विद्युतीय बिन्दुको pH स्थिति निरन्तर छ, र यो विधि विभिन्न प्रोटीनहरू विश्लेषण र तयार गर्न प्रयोग गर्न सकिन्छ।

6. आयन संचार क्रोमेटोग्राफी:

आयन कम्युनिकेसन एजेन्टहरूले cationic संचार एजेन्टहरू (जस्तै carboxymethyl सेल्युलोज; CM-सेलुलोज) र anionic संचार एजेन्टहरू (diethylaminoethyl cellulose) समावेश गर्दछ। आयन कम्युनिकेशन क्रोमेटोग्राफी स्तम्भबाट गुज्र्दा, आयन कम्युनिकेशन एजेन्टको विपरीत चार्ज भएको प्रोटिनलाई आयन कम्युनिकेशन एजेन्टमा अवशोषित गरिन्छ, र त्यसपछि सोखिन्छ।प्रोटिनpH वा ionic शक्ति परिवर्तन गरेर eluted छ।

7. एफिनिटी क्रोमेटोग्राफी:

एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी प्रोटीन अलग गर्न को लागी एक अत्यन्त उपयोगी विधि हो। उच्च शुद्धताको साथ गन्दा प्रोटीन मिश्रणबाट शुद्ध हुन निश्चित प्रोटीनलाई अलग गर्नको लागि प्राय: एक चरण मात्र चाहिन्छ।

यो विधि लिगान्ड (Ligand) भनिने अर्को अणुमा निश्चित प्रोटिनको सहसंयोजक बाइन्डिङमा आधारित छ।

आधारभूत सिद्धान्त:

प्रोटीनहरू ऊतक वा कोशिकाहरूमा गन्दा मिश्रणमा अवस्थित हुन्छन्, र प्रत्येक प्रकारको कोशिकामा हजारौं विभिन्न प्रोटीनहरू हुन्छन्। त्यसकारण, प्रोटीनहरू बीचको भिन्नता जैव रसायनको महत्त्वपूर्ण भाग हो, र यो एक्लै भएको छैन। वा तयार-बनाइएका विधिहरूको सेटले गन्दा मिश्रित प्रोटीनबाट कुनै पनि प्रकारको प्रोटीन हटाउन सक्छ, त्यसैले धेरै विधिहरू संयोजनमा प्रयोग गरिन्छ।