PCR FAQ 1. गलत नकारात्मक, कुनै एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड देखा पर्दैन 2. गलत सकारात्मक 3. गैर-विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्डहरू देखा पर्दछ 4. फ्ल्याकी ड्र्याग स्ट्रिपहरू वा स्मियर स्ट्रिपहरू देखा पर्दछ:

1 गलत नकारात्मक, कुनै एम्प्लीफाइड ब्यान्ड देखा पर्दैन PCR प्रतिक्रियाका मुख्य पक्षहरू हुन्

① टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिडको तयारी

② प्राइमर गुणस्तर र विशिष्टता

③ इन्जाइम गुणस्तर र

④ PCR चक्र अवस्थाहरू। कारणहरू पत्ता लगाउन माथिको लिङ्कहरूमा विश्लेषण र अनुसन्धान पनि सञ्चालन गर्नुपर्छ।

टेम्प्लेट:

① टेम्प्लेटमा अशुद्ध प्रोटीनहरू छन्

② टेम्प्लेटले Taq इन्जाइम अवरोधकहरू समावेश गर्दछ

③ टेम्प्लेटमा भएका प्रोटिनहरू पच्दैनन् र हटाइँदैनन्, विशेष गरी क्रोमोजोमहरूमा रहेका हिस्टोनहरू

④ निकासी र टेम्प्लेटको तयारीको क्रममा धेरै धेरै हराएको थियो, वा फिनोल सास फेरिएको थियो

⑤ टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिड पूर्ण रूपमा विकृत छैन। जब इन्जाइमहरू र प्राइमरहरूको गुणस्तर राम्रो हुन्छ, यदि एम्प्लीफिकेशन ब्यान्डहरू देखा पर्दैनन् भने, नमूनाको पाचन प्रक्रिया वा टेम्प्लेट न्यूक्लिक एसिड निकासी प्रक्रियामा केहि गडबड हुन सक्छ। त्यसकारण, एक प्रभावकारी र स्थिर पाचन समाधान तयार हुनुपर्छ, र प्रक्रिया निश्चित हुनुपर्छ र इच्छामा परिवर्तन गर्नु हुँदैन। । इन्जाइम निष्क्रियता: यो नयाँ इन्जाइम प्रतिस्थापन गर्न आवश्यक छ, वा एकै समयमा पुरानो र नयाँ इन्जाइमहरू प्रयोग गर्नुहोस् कि गलत नकारात्मकहरू हानि वा अपर्याप्त इन्जाइम गतिविधिको कारणले गर्दा विश्लेषण गर्न। यो ध्यान दिनुपर्छ कि कहिलेकाहीं Taq इन्जाइम बिर्सिएको छ। प्राइमरहरू: प्राइमर गुणस्तर, प्राइमर एकाग्रता, र दुई प्राइमरहरूको सांद्रता सममित छ कि छैन PCR विफलता वा असंतोषजनक एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड र सजिलो प्रसारको सामान्य कारणहरू हुन्। केही ब्याचहरूमा प्राइमर संश्लेषणको गुणस्तरमा समस्याहरू छन्। दुई प्राइमरहरू मध्ये एउटामा उच्च एकाग्रता छ र अर्कोमा कम एकाग्रता छ, परिणामस्वरूप कम दक्षता असममित प्रवर्धन हुन्छ।

प्रतिरोधी उपायहरू हुन्:

① राम्रो प्राइमर संश्लेषण इकाई चयन गर्नुहोस्।

② प्राइमरहरूको एकाग्रताले OD मान मात्र हेर्नु हुँदैन, तर agarose जेल इलेक्ट्रोफोरेसिसको लागि प्राइमर स्टक समाधानमा पनि ध्यान दिनुपर्छ। त्यहाँ प्राइमर ब्यान्डहरू हुनुपर्छ, र दुई प्राइमर ब्यान्डहरूको चमक लगभग समान हुनुपर्छ। उदाहरणका लागि, एउटा प्राइमरमा ब्यान्ड हुन्छ र अर्को प्राइमरमा कुनै ब्यान्ड हुँदैन। स्ट्रिपहरूका लागि, PCR यस समयमा असफल हुन सक्छ र प्राइमर संश्लेषण एकाइसँग वार्ताद्वारा समाधान गरिनुपर्छ। यदि एउटा प्राइमर उच्च चमक छ र अर्को कम चमक छ, प्राइमर पातलो गर्दा सांद्रता सन्तुलन।

③ फ्रिजमा बारम्बार चिसो र पग्लिन वा लामो समयसम्म भण्डारण हुनबाट जोगाउन प्राइमरहरूलाई उच्च एकाग्रता र थोरै मात्रामा भण्डारण गर्नुपर्छ, जसले प्राइमरहरू बिग्रन र खस्किन सक्छ।

④प्राइमर डिजाइन अव्यावहारिक छ, जस्तै प्राइमर लम्बाइ पर्याप्त छैन, डाइमरहरू प्राइमरहरू बीच बनाइन्छ, आदि। Mg2+ एकाग्रता: Mg2+ आयन एकाग्रताले PCR प्रवर्धन दक्षतामा ठूलो प्रभाव पार्छ। यदि एकाग्रता धेरै उच्च छ भने, यसले PCR प्रवर्धनको विशिष्टता कम गर्न सक्छ। यदि एकाग्रता धेरै कम छ भने, यसले PCR प्रवर्द्धन उपजलाई असर गर्छ र PCR एम्प्लीफिकेशनलाई एम्प्लीफाइङ्ग ब्यान्ड बिना असफल हुन पनि सक्छ। प्रतिक्रिया भोल्युममा परिवर्तनहरू: सामान्यतया PCR प्रवर्धनको लागि प्रयोग हुने भोल्युमहरू 20ul, 30ul, र 50ul हुन्छन्। वा 100ul, PCR प्रवर्धनको लागि कुन भोल्युम प्रयोग गर्नुपर्छ वैज्ञानिक अनुसन्धान र क्लिनिकल परीक्षणको विभिन्न उद्देश्यहरू अनुसार सेट गरिएको छ। सानो भोल्युम, जस्तै 20ul, र त्यसपछि ठूलो भोल्युम बनाएपछि, तपाईंले सर्तहरू पालना गर्नुपर्छ, अन्यथा यो सजिलै असफल हुनेछ। भौतिक कारणहरू: PCR एम्प्लीफिकेशनको लागि विकृतिकरण धेरै महत्त्वपूर्ण छ। यदि विकृतीकरणको तापमान कम छ र विकृतीकरण समय छोटो छ भने, गलत नकारात्मकहरू हुने सम्भावना धेरै हुन्छ; annealing तापमान धेरै कम छ, जसले गैर-विशिष्ट प्रवर्धन र विशिष्ट प्रवर्धन दक्षता कम गर्न सक्छ। annealing तापमान धेरै उच्च छ। टेम्प्लेटहरूमा प्राइमरहरूको बाइन्डिङलाई अत्यधिक प्रभाव पार्छ र PCR प्रवर्द्धन दक्षता घटाउँछ। कहिलेकाहीँ एम्प्लीफायर वा पानीमा घुलनशील भाँडोमा विकृतिकरण, एनिलिङ र एक्स्टेन्सन तापमान जाँच गर्न मानक थर्मोमिटर प्रयोग गर्न आवश्यक छ। पीसीआर फेल हुनुको एउटा कारण यो पनि हो । लक्ष्य अनुक्रम भिन्नता: यदि लक्ष्य अनुक्रम उत्परिवर्तित वा मेटाइएको छ, जसले टेम्प्लेटमा प्राइमरको विशिष्ट बाइन्डिङलाई असर गर्छ, वा प्राइमर र टेम्प्लेटले लक्ष्य अनुक्रमको एक निश्चित खण्ड मेटाउने कारणले पूरक अनुक्रम गुमाउँछ, PCR प्रवर्धन। सफल हुनेछैन।

2. False positive PCR एम्प्लीफिकेशन ब्यान्ड जुन देखिन्छ लक्ष्य अनुक्रम ब्यान्डसँग मिल्दोजुल्दो छ, र कहिलेकाहीँ ब्यान्ड अधिक व्यवस्थित र उज्यालो हुन्छ। अनुपयुक्त प्राइमर डिजाइन: चयन गरिएको एम्प्लीफिकेशन अनुक्रममा गैर-लक्ष्य एम्प्लिफिकेशन अनुक्रमसँग समानता छ, त्यसैले PCR प्रवर्द्धन गर्दा, एम्प्लीफाइड PCR उत्पादन एक गैर-लक्ष्य अनुक्रम हो। यदि लक्ष्य अनुक्रम धेरै छोटो छ वा प्राइमर धेरै छोटो छ भने, झूटा सकारात्मक सजिलै हुन सक्छ। प्राइमरहरू पुन: डिजाइन गर्न आवश्यक छ। लक्ष्य अनुक्रम वा एम्प्लीफिकेशन उत्पादनहरूको क्रस-प्रदूषण: यस प्रदूषणको दुई कारणहरू छन्: पहिलो, सम्पूर्ण जीनोम वा ठूला टुक्राहरूको क्रस-प्रदूषण, झूटा सकारात्मकहरू निम्त्याउँछ। यो झूटा सकारात्मक निम्न विधिहरूद्वारा समाधान गर्न सकिन्छ: नमूना बन्दुकमा चुस्न वा सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबबाट बाहिर निस्कन लक्षित अनुक्रमलाई रोक्नको लागि सञ्चालन गर्दा सावधान र नम्र हुनुहोस्। उच्च तापक्रम सहन नसक्ने इन्जाइमहरू र पदार्थहरू बाहेक, सबै अभिकर्मक वा उपकरणहरू उच्च दबाबद्वारा बाँझ गर्नुपर्छ। सबै सेन्ट्रीफ्यूज ट्यूबहरू र नमूना इंजेक्शन पिपेट टिपहरू एक पटक प्रयोग गर्नुपर्छ। यदि आवश्यक छ भने, प्रतिक्रिया ट्यूबहरू र अभिकर्मकहरूलाई पराबैंगनी प्रकाशको साथ विकिरण गरिएको छ नमूना थप्नु अघि उपस्थित न्यूक्लिक एसिडहरू नष्ट गर्न। दोस्रो हावामा न्यूक्लिक एसिडका साना टुक्राहरूको प्रदूषण हो। यी साना टुक्राहरू लक्ष्य अनुक्रम भन्दा छोटो छन्, तर निश्चित समरूपता छ। तिनीहरूलाई एकअर्कासँग जोड्न सकिन्छ, र प्राइमरहरूको पूरक भएपछि, PCR उत्पादनहरूलाई विस्तार गर्न सकिन्छ, फलस्वरूप झूटा सकारात्मक परिणामहरू, जुन नेस्टेड PCR विधिहरूद्वारा घटाउन वा हटाउन सकिन्छ।

 

3. गैर-विशिष्ट एम्प्लीफिकेशन ब्यान्डहरू देखा पर्छन् PCR एम्प्लीफिकेशन पछि देखा पर्ने ब्यान्डहरू अपेक्षित आकारसँग असंगत छन्, या त ठूला वा सानो, वा दुवै विशिष्ट प्रवर्द्धन ब्यान्डहरू र गैर-विशिष्ट प्रवर्धन ब्यान्डहरू एकै समयमा देखा पर्दछन्। गैर-विशिष्ट ब्यान्डहरूको उपस्थितिको कारणहरू हुन्: पहिलो, प्राइमरहरू लक्ष्य अनुक्रममा पूर्ण रूपमा पूरक हुँदैनन्, वा प्राइमरहरू डाइमरहरू बनाउनको लागि एकत्रित हुन्छन्। दोस्रो कारण Mg2+ आयन सांद्रता धेरै उच्च छ, annealing तापमान धेरै कम छ, र PCR चक्र संख्या धेरै उच्च छ। दोस्रो कारक इन्जाइमको गुणस्तर र मात्रा हो। केहि स्रोतहरूबाट इन्जाइमहरू प्रायः गैर-विशिष्ट ब्यान्डहरूमा प्रवण हुन्छन् तर अन्य स्रोतहरूबाट इन्जाइमहरू छैनन्। इन्जाइमहरूको अत्यधिक मात्राले कहिलेकाहीँ गैर-विशिष्ट प्रवर्धनको नेतृत्व गर्न सक्छ। काउन्टरमेजरहरूमा समावेश छ: आवश्यक भएमा प्राइमरहरू पुन: डिजाइन गर्नुहोस्। इन्जाइमको मात्रा घटाउनुहोस् वा अर्को स्रोतसँग बदल्नुहोस्। प्राइमरहरूको मात्रा घटाउनुहोस्, उपयुक्त रूपमा टेम्प्लेटको मात्रा बढाउनुहोस्, र चक्रहरूको संख्या घटाउनुहोस्। एनेलिङको तापक्रम उचित रूपमा बढाउनुहोस् वा दुई-तापमान बिन्दु विधि प्रयोग गर्नुहोस् (९३ डिग्री सेल्सियसमा विकृतिकरण, ६५ डिग्री सेल्सियस वरिपरि एनिलिङ र विस्तार)।

 

4. फ्ल्याकी ड्र्याग वा स्मियरहरू देखा पर्छन् PCR एम्प्लीफिकेशन कहिलेकाहीं स्मीयर ब्यान्ड, पाना-जस्तो ब्यान्ड वा कार्पेट-जस्तो ब्यान्डको रूपमा देखिन्छ। कारणहरू प्रायः धेरै इन्जाइम वा इन्जाइमको खराब गुणस्तर, धेरै उच्च dNTP एकाग्रता, धेरै उच्च Mg2+ एकाग्रता, धेरै कम एनिलिङ तापमान, र धेरै चक्रहरूका कारण हुन्छन्। प्रतिरोधी उपायहरूले समावेश गर्दछ: ① इन्जाइमको मात्रा घटाउनुहोस्, वा इन्जाइमलाई अर्को स्रोतमा बदल्नुहोस्। ②dNTP को एकाग्रता कम गर्नुहोस्। उचित रूपमा Mg2+ एकाग्रता कम गर्नुहोस्। टेम्प्लेटहरूको मात्रा बढाउनुहोस् र चक्रहरूको संख्या घटाउनुहोस्