PCR FAQ 1. False negative, amplification band မပေါ်ပါ 2. False positive 3. non-specific amplification bands များ ပေါ်လာခြင်း 4. မမြဲသော ဆွဲကြိုးများ သို့မဟုတ် smear strips များ ပေါ်လာသည်-

1False negative, amplified band မပေါ်လာခြင်း PCR တုံ့ပြန်မှု၏ အဓိကကျသော ရှုထောင့်များဖြစ်သည်။

① nucleic acid ပုံစံခွက်ပြင်ဆင်ခြင်း။

② primer အရည်အသွေးနှင့် တိကျမှု

③ အင်ဇိုင်းအရည်အသွေးနှင့်

④ PCR လည်ပတ်မှုအခြေအနေများ။ အကြောင်းရင်းများကို ရှာဖွေရန်၊ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းနှင့် သုတေသနပြုခြင်းများ ပြုလုပ်သင့်သည်။

နမူနာပုံစံ-

① ပုံစံခွက်တွင် မသန့်ရှင်းသော ပရိုတင်းများ ပါရှိသည်။

② ပုံစံခွက်တွင် Taq အင်ဇိုင်းတားဆေးများ ပါရှိသည်။

③ နမူနာပုံစံရှိ ပရိုတင်းများကို ကြေညက်စေပြီး အထူးသဖြင့် ခရိုမိုဆုန်းရှိ ဟစ်စတုန်းများကို ချေဖျက်၍မရပါ။

④ ပုံစံပလိတ်ကို ထုတ်ယူပြီး ပြင်ဆင်ချိန်အတွင်း အလွန်အကျွံ ဆုံးရှုံးသွားခြင်း သို့မဟုတ် ဖီနောကို ရှူသွင်းခြင်း

⑤ ပုံစံပလိတ်သည် နျူကလိယအက်ဆစ်သည် လုံးဝ denatured မဟုတ်ပါ။ အင်ဇိုင်းများနှင့် primers များ၏ အရည်အသွေး ကောင်းမွန်သောအခါ၊ အသံချဲ့စက်များ မပေါ်ပါက၊ နမူနာ၏ အစာခြေခြင်း လုပ်ငန်းစဉ် သို့မဟုတ် ပုံစံပလိတ် နျူကလိစ်အက်ဆစ် ထုတ်ယူသည့် လုပ်ငန်းစဉ်တွင် တစ်စုံတစ်ရာ မှားယွင်းမှု ဖြစ်နိုင်ခြေများပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ထိရောက်ပြီး တည်ငြိမ်သော အစာခြေဖြေရှင်းချက်အား ပြင်ဆင်ထားရန် လိုအပ်ပြီး လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို ပြုပြင်သင့်ပြီး အလိုအလျောက် မပြောင်းလဲသင့်ပါ။ . အင်ဇိုင်းမလှုပ်ရှားခြင်း- အင်ဇိုင်းအသစ်ကို အစားထိုးရန် လိုအပ်သည် သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်းအဟောင်းနှင့် အသစ်များကို တစ်ချိန်တည်းတွင် အသုံးပြု၍ မှားယွင်းသောအနုတ်လက္ခဏာများသည် ဆုံးရှုံးမှု သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်းမလုံလောက်ခြင်းကြောင့် ဖြစ်ပေါ်လာခြင်းရှိမရှိ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် လိုအပ်ပါသည်။ တစ်ခါတစ်ရံတွင် Taq အင်ဇိုင်းကို မေ့လျော့သွားကြောင်း သတိပြုသင့်သည်။ Primer များ- Primer အရည်အသွေး၊ primer အာရုံစူးစိုက်မှုနှင့် primer နှစ်ခု၏ ပြင်းအား အချိုးညီမှုရှိမရှိတို့သည် PCR ချို့ယွင်းမှု သို့မဟုတ် ကျေနပ်ဖွယ်မရှိသော အသံချဲ့စက်များနှင့် ပျံ့နှံ့လွယ်သော အကြောင်းရင်းများဖြစ်သည်။ အချို့အသုတ်များတွင် primer ပေါင်းစပ်မှုအရည်အသွေးနှင့် ပြဿနာများရှိသည်။ Primer နှစ်ခုအနက် တစ်ခုမှာ အာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားပြီး နောက်တစ်ခုသည် အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းသောကြောင့် စွမ်းဆောင်ရည်နိမ့်သော အချိုးမညီသော ချဲ့ထွင်မှုကို ရရှိစေသည်။

တန်ပြန်ဆောင်ရွက်မှုများမှာ-

① ကောင်းသော primer ပေါင်းစပ်မှုယူနစ်ကို ရွေးချယ်ပါ။

② primers များ၏ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် OD တန်ဖိုးကို ကြည့်ရုံသာမက agarose gel electrophoresis အတွက် primer stock solution ကို အာရုံစိုက်သင့်သည်။ primer bands ရှိရမည်၊ primer band နှစ်ခု၏တောက်ပမှုသည်အကြမ်းဖျင်းတူညီသင့်သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ primer တစ်ခုတွင် band တစ်ခုရှိပြီး အခြား primer တွင် band မရှိပါ။ strips များအတွက်၊ PCR သည် ယခုအချိန်တွင် ကျရှုံးနိုင်ပြီး primer synthesis unit နှင့် ညှိနှိုင်းခြင်းဖြင့် ဖြေရှင်းသင့်ပါသည်။ primer တစ်ခုတွင် တောက်ပမှု မြင့်မားပြီး နောက်တစ်ခုသည် တောက်ပမှုနည်းပါက၊ primer ကို ဖျော့လိုက်သောအခါ ပြင်းအားကို ချိန်ညှိပါ။

③ ထပ်ခါတလဲလဲ အေးခဲပြီး အရည်ပျော်ခြင်း သို့မဟုတ် ရေခဲသေတ္တာထဲတွင် ကြာရှည်သိမ်းဆည်းခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် Primers များကို ပြင်းအားမြင့်ပြီး ပမာဏအနည်းငယ်ဖြင့် သိမ်းဆည်းထားသင့်ပြီး Primer များ ယိုယွင်းပျက်စီးယိုယွင်းလာစေနိုင်သောကြောင့် ရေခဲသေတ္တာထဲတွင် အချိန်ကြာမြင့်စွာ သိမ်းဆည်းထားသင့်ပါသည်။

④ primer ဒီဇိုင်းသည် ကျိုးကြောင်းဆီလျော်မှုမရှိပါ၊ ဥပမာ- primer အရှည်မလုံလောက်ပါ၊ primers များကြားတွင် dimers များ စသည်တို့ဖြစ်သည်။ Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှု- Mg2+ ion concentration သည် PCR amplification efficiency အပေါ် ကြီးမားသောလွှမ်းမိုးမှုရှိပါသည်။ အာရုံစူးစိုက်မှု အလွန်မြင့်မားပါက၊ ၎င်းသည် PCR ချဲ့ထွင်မှု၏ တိကျမှုကို လျှော့ချနိုင်သည်။ အာရုံစူးစိုက်မှုနည်းလွန်းပါက၊ ၎င်းသည် PCR အသံချဲ့စက်အထွက်နှုန်းကို ထိခိုက်စေပြီး PCR amplification ကို အသံချဲ့ထွင်ခြင်းမပြုဘဲ ပျက်ကွက်သွားစေသည်။ တုံ့ပြန်မှုပမာဏပြောင်းလဲမှု- PCR ချဲ့ထွင်မှုအတွက် အသုံးပြုသည့် ပမာဏများသည် အများအားဖြင့် 20ul၊ 30ul နှင့် 50ul ဖြစ်သည်။ သို့မဟုတ် 100ul၊ PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းအတွက် မည်သည့်ပမာဏကို အသုံးပြုသင့်သည်ကို သိပ္ပံနည်းကျ သုတေသနနှင့် လက်တွေ့စမ်းသပ်ခြင်း၏ ရည်ရွယ်ချက်အမျိုးမျိုးဖြင့် သတ်မှတ်သည်။ 20ul ကဲ့သို့သော သေးငယ်သော ထုထည်တစ်ခု ပြုလုပ်ပြီးနောက် ပိုမိုကြီးမားသော ထုထည်ကို ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ သင်သည် အခြေအနေများကို လိုက်နာရမည်၊ မဟုတ်ပါက အလွယ်တကူ ပျက်သွားမည်ဖြစ်သည်။ ရုပ်ပိုင်းဆိုင်ရာ အကြောင်းရင်းများ- PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းအတွက် Denaturation သည် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ denaturation temperature နိမ့်ပြီး denaturation time တိုတောင်းပါက၊ false negatives များ ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်ချေများပါသည်။ annealing temperature သည် နိမ့်လွန်းသဖြင့်၊ အတိအကျမဟုတ်သော အသံချဲ့စက်ကို ဖြစ်စေနိုင်ပြီး သီးခြား amplification efficiency ကို လျှော့ချနိုင်သည်။ လိမ်းထားသော အပူချိန်သည် အလွန်မြင့်မားသည်။ တင်းပလိတ်များနှင့် primers များ ချိတ်ဆက်မှုကို လွန်စွာအကျိုးသက်ရောက်ပြီး PCR ချဲ့ထွင်မှုစွမ်းဆောင်ရည်ကို လျော့နည်းစေသည်။ တစ်ခါတစ်ရံတွင် အသံချဲ့စက် သို့မဟုတ် ရေတွင်ပျော်ဝင်နိုင်သော အိုးအတွင်းရှိ denaturation၊ annealing နှင့် extension temperatures ကို စစ်ဆေးရန် ပုံမှန်သာမိုမီတာကို အသုံးပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။ ဤသည်မှာ PCR ပျက်ကွက်ခြင်း၏ အကြောင်းရင်းတစ်ခုလည်းဖြစ်သည်။ ပစ်မှတ် sequence ကွဲလွဲမှု- ပစ်မှတ် sequence ကို ပြောင်းလိုက်ခြင်း သို့မဟုတ် ဖျက်လိုက်လျှင်၊ သို့မဟုတ် primer ၏ template နှင့် primer ၏ သီးခြားချိတ်ဆက်မှုကို ထိခိုက်စေသော သို့မဟုတ် primer နှင့် template သည် target sequence ၏ အပိုင်းအချို့ကို ဖျက်လိုက်ခြင်းကြောင့် ဖြည့်စွက်အစီအစဥ် ဆုံးရှုံးသွားခြင်း၊ PCR ချဲ့ထွင်ခြင်း အောင်မြင်မည်မဟုတ်ပါ။

2.false positive ပေါ်လာသော PCR အသံချဲ့စက်သည် ပစ်မှတ်အစီအစဥ်တီးဝိုင်းနှင့် ကိုက်ညီပြီး တစ်ခါတစ်ရံတွင် တီးဝိုင်းသည် ပိုမိုစနစ်တကျနှင့် ပိုမိုတောက်ပသည်။ မသင့်လျော်သော primer ဒီဇိုင်း- ရွေးချယ်ထားသော ချဲ့ထွင်မှုအစီအစဥ်တွင် ပစ်မှတ်မဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုအစီအစဥ်နှင့် တူညီမှုရှိသည်၊ ထို့ကြောင့် PCR ချဲ့ထွင်မှုကို လုပ်ဆောင်သောအခါ၊ ချဲ့ထွင်ထားသော PCR ထုတ်ကုန်သည် ပစ်မှတ်မဟုတ်သော အမျိုးအစားတစ်ခုဖြစ်သည်။ ပစ်မှတ် sequence တိုလွန်းလျှင် သို့မဟုတ် primer တိုလွန်းပါက၊ false positive များ အလွယ်တကူ ဖြစ်ပေါ်နိုင်သည်။ Primers များကို ပြန်လည်ဒီဇိုင်းထုတ်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ပစ်မှတ်အစီအစဥ်များ သို့မဟုတ် ချဲ့ထွင်ခြင်းထုတ်ကုန်များ၏ ဖြတ်ကျော်ညစ်ညမ်းခြင်း- ဤညစ်ညမ်းခြင်းအတွက် အကြောင်းရင်းနှစ်ခုရှိသည်- ပထမ၊ ဂျီနိုမ်တစ်ခုလုံး သို့မဟုတ် ကြီးမားသောအပိုင်းအစများကို ဖြတ်ကျော်ညစ်ညမ်းစေပြီး မှားယွင်းသောအပြုသဘောများဖြစ်ပေါ်စေသည်။ ဤမှားယွင်းသောအပြုသဘောကို အောက်ပါနည်းလမ်းများဖြင့် ဖြေရှင်းနိုင်သည်- ပစ်မှတ်ကို နမူနာသေနတ်ထဲသို့ စုပ်ယူခြင်း သို့မဟုတ် စင်ထရီဖန်းပြွန်အတွင်းမှ ကွဲထွက်ခြင်းမှ ကာကွယ်ရန် လည်ပတ်သည့်အခါ သတိနှင့် ညင်သာစွာ လုပ်ဆောင်ပါ။ မြင့်မားသောအပူချိန်ကို ခံနိုင်ရည်မရှိသော အင်ဇိုင်းများနှင့် အရာဝတ္ထုများမှလွဲ၍၊ ဓာတ်ပစ္စည်းများ သို့မဟုတ် ပစ္စည်းအားလုံးကို မြင့်မားသောဖိအားဖြင့် ပိုးသတ်သင့်သည်။ centrifuge tubes နှင့် sample injection pipette အကြံပြုချက်များအားလုံးကို တစ်ကြိမ်အသုံးပြုသင့်သည်။ လိုအပ်ပါက နမူနာကို မထည့်မီ တုံ့ပြန်မှုပြွန်များနှင့် ဓာတ်ပစ္စည်းများကို ခရမ်းလွန်ရောင်ခြည်ဖြင့် ဓာတ်ရောင်ခြည်ပေးကာ နျူကလိယအက်ဆစ်များကို ဖျက်ဆီးပစ်သည်။ ဒုတိယအချက်မှာ လေထုထဲတွင် နျူကလိယအက်ဆစ် အပိုင်းအစလေးများ ညစ်ညမ်းခြင်း ဖြစ်သည်။ ဤအပိုင်းအစလေးများသည် ပစ်မှတ်အစီအစဥ်ထက် ပိုတိုသော်လည်း တူညီမှုအချို့ရှိသည်။ ၎င်းတို့သည် တစ်ခုနှင့်တစ်ခု ပေါင်းစပ်နိုင်ပြီး၊ primers များနှင့် ဖြည့်စွက်ပြီးနောက် PCR ထုတ်ကုန်များကို ချဲ့ထွင်နိုင်ပြီး၊ nested PCR နည်းလမ်းများဖြင့် လျှော့ချနိုင်သည် သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားပစ်နိုင်သည့် false positives များကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။

 

3. Non-specific amplification bands များပေါ်လာသည် PCR amplification ပြီးနောက်ပေါ်လာသော bands များသည် မျှော်မှန်းအရွယ်အစား၊ ပိုကြီးသည်ဖြစ်စေ၊ သေးသည်ဖြစ်စေ သို့မဟုတ် သီးခြား amplification bands နှင့် သီးခြားမဟုတ်သော amplification band နှစ်ခုလုံးသည် တစ်ချိန်တည်းတွင်ပေါ်လာမည်ဖြစ်သည်။ အတိအကျမဟုတ်သော ကြိုးဝိုင်းများ ပေါ်လာရခြင်း၏ အကြောင်းရင်းများမှာ- ပထမ၊ primers များသည် target sequence နှင့် လုံးဝ လိုက်ဖက်ညီခြင်း မရှိပါ၊ သို့မဟုတ် primers များသည် dimers များအဖြစ် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ဒုတိယအကြောင်းရင်းမှာ Mg2+ အိုင်းယွန်းအာရုံစူးစိုက်မှု မြင့်မားလွန်းခြင်း၊ annealing temperature နိမ့်လွန်းခြင်းနှင့် PCR လည်ပတ်မှု အရေအတွက် မြင့်မားခြင်းတို့ကြောင့် ဖြစ်သည်။ ဒုတိယအချက်မှာ အင်ဇိုင်း၏ အရည်အသွေးနှင့် ပမာဏဖြစ်သည်။ အချို့သော အရင်းအမြစ်များမှ အင်ဇိုင်းများသည် တိကျသောမဟုတ်သော ကြိုးဝိုင်းများသို့ ကျရောက်တတ်သော်လည်း အခြားရင်းမြစ်များမှ အင်ဇိုင်းများ မပါရှိပါ။ အင်ဇိုင်းပမာဏ အလွန်အကျွံသည် တစ်ခါတစ်ရံတွင် အတိအကျမဟုတ်သော ချဲ့ထွင်မှုကို ဖြစ်စေနိုင်သည်။ တန်ပြန်ဆောင်ရွက်ချက်များတွင်- လိုအပ်ပါက primer များကို ပြန်လည်ဒီဇိုင်းဆွဲပါ။ အင်ဇိုင်းပမာဏကို လျှော့ချပါ သို့မဟုတ် ၎င်းကို အခြားအရင်းအမြစ်တစ်ခုဖြင့် အစားထိုးပါ။ primer ပမာဏကို လျှော့ချပါ၊ ပုံစံခွက်ပမာဏကို သင့်လျော်သလို တိုးမြှင့်ကာ သံသရာအရေအတွက်ကို လျှော့ချပါ။ annealing အပူချိန်ကို သင့်လျော်စွာ တိုးမြှင့်ပါ သို့မဟုတ် အပူချိန်နှစ်မှတ်နည်းလမ်းကို အသုံးပြုပါ (93°C တွင် denaturation၊ annealing နှင့် 65°C ဝန်းကျင်တွင် ထပ်တိုးခြင်း)။

 

4. Flaky drag သို့မဟုတ် smears သည် PCR ချဲ့ထွင်ခြင်း သည် တစ်ခါတစ်ရံတွင် လိမ်းကျံထားသော တီးဝိုင်းများ၊ စာရွက်ကဲ့သို့ တီးဝိုင်းများ သို့မဟုတ် ကော်ဇောကဲ့သို့ တီးဝိုင်းများအဖြစ် ပေါ်လာသည်။ အကြောင်းရင်းများသည် အင်ဇိုင်းများလွန်းခြင်း သို့မဟုတ် အရည်အသွေးညံ့ဖျင်းခြင်း၊ မြင့်မားသော dNTP အာရုံစူးစိုက်မှုမြင့်မားခြင်း၊ Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှုမြင့်မားလွန်းခြင်း၊ အပူချိန်နိမ့်လွန်းခြင်းနှင့် သံသရာလည်လွန်းခြင်းတို့ကြောင့် ဖြစ်တတ်သည်။ တန်ပြန်ဆောင်ရွက်မှုများတွင်- ① အင်ဇိုင်းပမာဏကို လျှော့ချပါ၊ သို့မဟုတ် အင်ဇိုင်းကို အခြားအရင်းအမြစ်တစ်ခုဖြင့် အစားထိုးပါ။ ② dNTP ၏အာရုံစူးစိုက်မှုကိုလျှော့ချပါ။ Mg2+ အာရုံစူးစိုက်မှုကို သင့်လျော်စွာ လျှော့ချပါ။ တင်းပလိတ်ပမာဏကို တိုးစေပြီး သံသရာအရေအတွက်ကို လျှော့ချပါ။