FAQ tal-PCR 1. Negattiv falz, ma tidher l-ebda faxxa ta 'amplifikazzjoni 2. Pożittiv falz 3. Jidhru meded ta' amplifikazzjoni mhux speċifiċi 4. Jidhru strixxi ta 'drag flaky jew strixxi smear:
1Falz negattiv, ma tidher l-ebda faxxa amplifikata L-aspetti ewlenin tar-reazzjoni tal-PCR huma
① preparazzjoni ta 'aċidu nuklejku template
② kwalità tal-primer u speċifiċità
③ kwalità tal-enzima u
④ Kundizzjonijiet taċ-ċiklu tal-PCR. Biex issib ir-raġunijiet, l-analiżi u r-riċerka għandhom isiru wkoll fuq il-links ta 'hawn fuq.
Mudell:
① Il-mudell fih proteini ta 'impurità
② Il-mudell fih inibituri tal-enzimi Taq
③ Il-proteini fil-mudell ma jiġux diġeriti u mneħħija, speċjalment l-istoni fil-kromożomi
④ Intilef wisq waqt l-estrazzjoni u l-preparazzjoni tal-mudell, jew il-fenol ġie inalat
⑤L-aċidu nuklejku tal-mudell mhuwiex kompletament żnaturat. Meta l-kwalità ta 'enżimi u primers hija tajba, jekk il-meded ta' amplifikazzjoni ma jidhrux, huwa probabbli ħafna li jkun hemm xi ħaġa ħażina fil-proċess ta 'diġestjoni tal-kampjun jew il-proċess ta' estrazzjoni ta 'aċidu nuklejku template. Għalhekk, trid tiġi ppreparata soluzzjoni ta 'diġestjoni effettiva u stabbli, u l-proċedura għandha tiġi ffissata u m'għandhiex tinbidel skont ir-rieda. . Inattivazzjoni tal-enzimi: Huwa meħtieġ li tissostitwixxi l-enzima l-ġdida, jew tuża kemm enzimi qodma kif ukoll ġodda fl-istess ħin biex tanalizza jekk negattivi foloz humiex ikkawżati minn telf jew attività tal-enzima insuffiċjenti. Għandu jiġi nnutat li xi drabi l-enzima Taq tkun minsija.Primers: Kwalità tal-primer, konċentrazzjoni tal-primer, u jekk il-konċentrazzjonijiet taż-żewġ primers humiex simmetriċi huma raġunijiet komuni għal falliment tal-PCR jew meded ta 'amplifikazzjoni mhux sodisfaċenti u diffużjoni faċli. Hemm problemi bil-kwalità tas-sinteżi tal-primer f'xi lottijiet. Wieħed miż-żewġ primers għandu konċentrazzjoni għolja u l-ieħor għandu konċentrazzjoni baxxa, li jirriżulta f'amplifikazzjoni asimmetrika b'effiċjenza baxxa.
Il-kontromiżuri huma:
① Agħżel unità ta 'sintesi tal-primer tajba.
② Il-konċentrazzjoni tal-primers għandha mhux biss tħares lejn il-valur OD, iżda wkoll tagħti attenzjoni lis-soluzzjoni tal-istokk tal-primer għall-elettroforesi tal-ġel tal-agarose. Għandu jkun hemm faxex primer, u l-luminożità taż-żewġ faxex primer għandha tkun bejn wieħed u ieħor l-istess. Pereżempju, primer wieħed għandu faxxa u l-primer l-ieħor m'għandux faxxa. Għall-istrixxi, il-PCR jista 'jfalli f'dan il-ħin u għandu jiġi solvut permezz ta' negozjar mal-unità tas-sintesi tal-primer. Jekk primer għandu luminożità għolja u l-ieħor għandu luminożità baxxa, ibbilanċja l-konċentrazzjonijiet meta ddilwixxi l-primers.
③ Primers għandhom jinħażnu f'konċentrazzjoni għolja u kwantitajiet żgħar biex jipprevjenu l-iffriżar u t-tidwib ripetuti jew ħażna fit-tul fil-friġġ, li jista 'jwassal għal deterjorazzjoni u degradazzjoni tal-primers.
④Id-disinn tal-primer mhuwiex raġonevoli, bħat-tul tal-primer mhuwiex biżżejjed, id-dimeri huma ffurmati bejn il-primers, eċċ Konċentrazzjoni ta 'Mg2+: Il-konċentrazzjoni tal-jone Mg2+ għandha influwenza kbira fuq l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR. Jekk il-konċentrazzjoni hija għolja wisq, tista 'tnaqqas l-ispeċifiċità tal-amplifikazzjoni tal-PCR. Jekk il-konċentrazzjoni tkun baxxa wisq, se taffettwa r-rendiment tal-amplifikazzjoni tal-PCR u saħansitra tikkawża li l-amplifikazzjoni tal-PCR tfalli mingħajr meded ta 'amplifikazzjoni. Bidliet fil-volum tar-reazzjoni: Normalment il-volumi użati għall-amplifikazzjoni tal-PCR huma 20ul, 30ul, u 50ul. Jew 100ul, liema volum għandu jintuża għall-amplifikazzjoni tal-PCR huwa stabbilit skont skopijiet differenti ta 'riċerka xjentifika u ttestjar kliniku. Wara li tagħmel volum żgħir, bħal 20ul, u mbagħad tagħmel volum akbar, trid issegwi l-kundizzjonijiet, inkella tfalli faċilment. Raġunijiet fiżiċi: Id-denaturazzjoni hija importanti ħafna għall-amplifikazzjoni tal-PCR. Jekk it-temperatura tad-denaturazzjoni hija baxxa u l-ħin tad-denaturazzjoni huwa qasir, x'aktarx li jseħħu negattivi foloz; it-temperatura ta 'l-ittemprar hija baxxa wisq, li tista' tikkawża amplifikazzjoni mhux speċifika u tnaqqas l-effiċjenza ta 'amplifikazzjoni speċifika. It-temperatura ta 'l-ittemprar hija għolja wisq. Taffettwa ħafna l-irbit tal-primers mal-mudelli u jnaqqas l-effiċjenza tal-amplifikazzjoni tal-PCR. Xi drabi huwa meħtieġ li tuża termometru standard biex tiċċekkja t-temperaturi ta 'denaturazzjoni, ittemprar u estensjoni fl-amplifikatur jew borma li tinħall fl-ilma. Din hija wkoll waħda mir-raġunijiet għall-falliment tal-PCR. Varjazzjoni tas-sekwenza fil-mira: Jekk is-sekwenza fil-mira tiġi mutata jew imħassra, li taffettwa r-rabta speċifika tal-primer mal-mudell, jew il-primer u l-mudell jitilfu s-sekwenza komplementari minħabba t-tħassir ta 'ċertu segment tas-sekwenza fil-mira, l-amplifikazzjoni tal-PCR mhux se jkun ta’ suċċess.
2.pożittiv falz Il-medda ta 'amplifikazzjoni tal-PCR li tidher hija konsistenti mal-medda tas-sekwenza fil-mira, u xi kultant il-medda hija aktar ordnata u isbaħ. Disinn mhux xieraq tal-primer: Is-sekwenza ta 'amplifikazzjoni magħżula għandha omoloġija mas-sekwenza ta' amplifikazzjoni mhux fil-mira, għalhekk meta twettaq amplifikazzjoni tal-PCR, il-prodott tal-PCR amplifikat huwa sekwenza mhux fil-mira. Jekk is-sekwenza fil-mira hija qasira wisq jew il-primer huwa qasir wisq, jistgħu faċilment iseħħu pożittivi foloz. Primers jeħtieġ li jiġu ddisinjati mill-ġdid. Kontaminazzjoni inkroċjata ta 'sekwenzi fil-mira jew prodotti ta' amplifikazzjoni: Hemm żewġ raġunijiet għal din il-kontaminazzjoni: L-ewwel, kontaminazzjoni inkroċjata tal-ġenoma kollu jew frammenti kbar, li twassal għal pożittivi foloz. Dan il-pożittiv falz jista 'jiġi solvut bil-metodi li ġejjin: Oqgħod attent u ġentili meta topera biex tevita li s-sekwenza fil-mira tiġi miġbuda fil-pistola tal-kampjun jew titlaq mit-tubu taċ-ċentrifuga. Ħlief għal enzimi u sustanzi li ma jistgħux jifilħu temperaturi għoljin, ir-reaġenti jew it-tagħmir kollu għandhom jiġu sterilizzati bi pressjoni għolja. It-tubi taċ-ċentrifugi kollha u l-ponot tal-pipetta tal-injezzjoni tal-kampjuni għandhom jintużaw darba. Jekk meħtieġ, it-tubi tar-reazzjoni u r-reaġenti huma irradjati b'dawl ultravjola qabel ma żżid il-kampjun biex jeqirdu l-aċidi nuklejċi preżenti. It-tieni hija l-kontaminazzjoni ta 'frammenti żgħar ta' aċidi nuklejċi fl-arja. Dawn il-frammenti żgħar huma iqsar mis-sekwenza fil-mira, iżda għandhom ċerta omoloġija. Jistgħu jiġu spliced ma 'xulxin, u wara li jkunu komplementari għall-primers, il-prodotti tal-PCR jistgħu jiġu amplifikati, li jirriżultaw f'pożittivi foloz, li jistgħu jitnaqqsu jew jiġu eliminati b'metodi ta' PCR nested.
3.Jidhru meded ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi Il-meded li jidhru wara l-amplifikazzjoni tal-PCR huma inkonsistenti mad-daqs mistenni, jew akbar jew iżgħar, jew iż-żewġ meded ta' amplifikazzjoni speċifiċi u meded ta 'amplifikazzjoni mhux speċifiċi jidhru fl-istess ħin. Ir-raġunijiet għad-dehra ta 'meded mhux speċifiċi huma: l-ewwel, il-primers mhumiex kompletament komplementari għas-sekwenza fil-mira, jew il-primers jingħaqdu biex jiffurmaw dimeri. It-tieni raġuni hija li l-konċentrazzjoni tal-jone Mg2 + hija għolja wisq, it-temperatura tal-ittemprar hija baxxa wisq, u n-numru ta 'ċikli PCR huwa għoli wisq. It-tieni fattur huwa l-kwalità u l-kwantità tal-enzima. L-enzimi minn xi sorsi ħafna drabi huma suxxettibbli għal meded mhux speċifiċi iżda l-enzimi minn sorsi oħra ma jagħmlux dan. Ammonti eċċessivi ta 'enzimi jistgħu kultant iwasslu għal amplifikazzjoni mhux speċifika. Il-kontromiżuri jinkludu: disinn mill-ġdid tal-primers jekk meħtieġ. Naqqas l-ammont ta' enzima jew ibdelha b'sors ieħor. Naqqas l-ammont ta 'primers, żid l-ammont ta' mudell b'mod xieraq, u naqqas in-numru ta 'ċikli. Żid it-temperatura ta 'l-ittemprar b'mod xieraq jew uża l-metodu ta' żewġ punti ta 'temperaturi (denaturazzjoni f'93 ° C, ittemprar u estensjoni madwar 65 ° C).
4.Faky drag jew smears jidhru l-amplifikazzjoni tal-PCR kultant tidher bħala meded smeared, faxex bħal folji jew faxex bħal tapit. Ir-raġunijiet ħafna drabi huma kkawżati minn enzima wisq jew kwalità fqira ta 'enżima, konċentrazzjoni għolja wisq ta' dNTP, konċentrazzjoni għolja wisq ta 'Mg2+, temperatura ta' ttemprar baxxa wisq, u ċikli wisq. Il-kontromiżuri jinkludu: ① Naqqas l-ammont ta 'enzima, jew ibdel l-enzima b'sors ieħor. ②Naqqas il-konċentrazzjoni ta 'dNTP. Naqqas b'mod xieraq il-konċentrazzjoni Mg2+. Żid l-ammont ta 'mudelli u tnaqqas in-numru ta' ċikli
