Pengasingan dan penulenan protein digunakan secara meluas dalam penyelidikan dan aplikasi biokimia dan merupakan kemahiran operasi yang penting. Sel eukariotik biasa boleh mengandungi beribu-ribu protein yang berbeza, ada yang sangat kaya dan ada yang mengandungi hanya beberapa salinan. Untuk mengkaji sesuatu yang tertentuprotein, perlu terlebih dahulu membersihkan protein daripada protein lain dan molekul bukan protein.

1. Kaedah pengasinanprotein:

Garam neutral mempunyai kesan yang ketara terhadap keterlarutan protein. Secara amnya, dengan peningkatan kepekatan garam di bawah kepekatan garam yang rendah, keterlarutan protein meningkat. Ini dipanggil pengasinan; apabila kepekatan garam terus meningkat, Keterlarutan protein berkurangan kepada darjah yang berbeza-beza dan memisahkan satu demi satu. Fenomena ini dipanggil salting out.

2. Kaedah susun titik isoelektrik:

Tolakan elektrostatik antara zarah adalah yang paling kecil apabila protein adalah statik, jadi keterlarutan juga yang paling kecil. Titik isoelektrik pelbagai protein adalah berbeza. pH larutan penyaman boleh digunakan untuk mencapai titik isoelektrik protein Jadikan ia terkumpul, tetapi kaedah ini jarang digunakan secara bersendirian dan boleh digabungkan dengan kaedah pengasinan.

3. Dialisis dan ultraturasan:

Dialisis menggunakan membran separa telap untuk memisahkan protein dengan saiz molekul yang berbeza. Kaedah ultraturasan menggunakan tekanan tinggi atau daya emparan untuk membuat air dan molekul terlarut kecil lain melalui membran separa telap, manakalaproteinkekal pada membran. Anda boleh memilih saiz liang yang berbeza untuk memintas protein dengan berat molekul yang berbeza.

4. Kaedah penapisan gel:

Juga dipanggil kromatografi pengecualian saiz atau kromatografi ayak molekul, ini adalah salah satu kaedah yang paling berguna untuk mengasingkan campuran protein mengikut saiz molekul. Bahan pembungkus yang lebih biasa digunakan dalam lajur ialah gel glukosa (Sephadex ged) dan gel agarose (gel agarose).

5. Elektroforesis:

Di bawah keadaan pH yang sama, pelbagai protein boleh diasingkan kerana berat molekulnya yang berbeza dan cas yang berbeza dalam medan elektrik. Perlu diberi perhatian kepada elektroforesis set isoelektrik, yang menggunakan amfolit sebagai pembawa. Semasa elektroforesis, amfolit membentuk kecerunan pH secara beransur-ansur dari elektrod positif ke elektrod negatif. Apabila protein dengan cas tertentu berenang di dalamnya, ia akan mencapai satu sama lain. Kedudukan pH titik elektrik tidak berterusan, dan kaedah ini boleh digunakan untuk menganalisis dan menyediakan pelbagai protein.

6. Kromatografi komunikasi ion:

agen komunikasi ion termasuk agen komunikasi kationik (seperti karboksimetil selulosa; CM-selulosa) dan agen komunikasi anionik (diethylaminoethyl cellulose). Apabila melalui lajur kromatografi komunikasi ion, protein dengan cas yang bertentangan dengan agen komunikasi ion diserap pada agen komunikasi ion, dan kemudian diserap.proteindielusi dengan mengubah pH atau kekuatan ion.

7. Kromatografi perkaitan:

Kromatografi pertalian ialah kaedah yang sangat berguna untuk mengasingkan protein. Ia selalunya memerlukan hanya satu langkah untuk memisahkan protein tertentu untuk disucikan daripada campuran protein yang tidak kemas dengan ketulenan tinggi.

Kaedah ini berdasarkan pengikatan spesifik dan bukannya kovalen protein tertentu kepada molekul lain yang dipanggil ligan (Ligan).

Prinsip asas:

protein wujud dalam campuran yang tidak kemas dalam tisu atau sel, dan setiap jenis sel mengandungi beribu-ribu protein yang berbeza. Oleh itu, perbezaan antara protein adalah bahagian penting dalam biokimia, dan ia tidak bersendirian. Atau satu set kaedah sedia boleh mengeluarkan apa-apa jenis protein daripada protein campuran yang tidak kemas, jadi beberapa kaedah sering digunakan dalam kombinasi.