PCR FAQ 1. फॉल्स निगेटिव्ह, एम्प्लिफिकेशन बँड दिसत नाही 2. फॉल्स पॉझिटिव्ह 3. नॉन-स्पेसिफिक ॲम्प्लिफिकेशन बँड दिसतात 4. फ्लॅकी ड्रॅग स्ट्रिप्स किंवा स्मीअर स्ट्रिप्स दिसतात：

1खोटे नकारात्मक, कोणताही प्रवर्धित बँड दिसत नाही पीसीआर प्रतिक्रियेचे मुख्य पैलू आहेत

① टेम्प्लेट न्यूक्लिक ॲसिड तयार करणे

② प्राइमर गुणवत्ता आणि विशिष्टता

③ एंजाइम गुणवत्ता आणि

④ PCR सायकल परिस्थिती. कारणे शोधण्यासाठी वरील लिंक्सवरही विश्लेषण आणि संशोधन केले पाहिजे.

साचा:

① टेम्पलेटमध्ये अशुद्धता प्रथिने असतात

② टेम्पलेटमध्ये Taq एन्झाइम इनहिबिटर आहेत

③ टेम्प्लेटमधील प्रथिने पचली जात नाहीत आणि काढून टाकली जात नाहीत, विशेषतः गुणसूत्रांमधील हिस्टोन्स

④ टेम्प्लेट काढताना आणि तयार करताना खूप जास्त वाया गेले किंवा फिनॉल श्वास घेतला गेला

⑤ टेम्प्लेट न्यूक्लिक ॲसिड पूर्णपणे विकृत केलेले नाही. जेव्हा एन्झाईम्स आणि प्राइमर्सची गुणवत्ता चांगली असते, जर ॲम्प्लीफिकेशन बँड दिसत नसतील, तर बहुधा नमुन्याच्या पचन प्रक्रियेत किंवा टेम्प्लेट न्यूक्लिक ॲसिड काढण्याच्या प्रक्रियेत काहीतरी चूक झाली आहे. म्हणून, एक प्रभावी आणि स्थिर पचन उपाय तयार करणे आवश्यक आहे, आणि प्रक्रिया निश्चित केली पाहिजे आणि इच्छेनुसार बदलू नये. . एन्झाईम निष्क्रिय करणे: नवीन एन्झाइम बदलणे आवश्यक आहे किंवा जुन्या आणि नवीन दोन्ही एन्झाईम्सचा एकाच वेळी वापर करणे आवश्यक आहे की खोटे नकारात्मक नुकसान किंवा अपर्याप्त एन्झाइम क्रियाकलापांमुळे होते की नाही याचे विश्लेषण करण्यासाठी. हे लक्षात घेतले पाहिजे की कधीकधी Taq एन्झाइम विसरला जातो. प्राइमर: प्राइमर गुणवत्ता, प्राइमर एकाग्रता आणि दोन प्राइमर्सची एकाग्रता सममितीय आहे की नाही ही PCR अयशस्वी किंवा असमाधानकारक प्रवर्धन बँड आणि सहज प्रसार होण्याची सामान्य कारणे आहेत. काही बॅचमध्ये प्राइमर संश्लेषणाच्या गुणवत्तेत समस्या आहेत. दोन प्राइमर्सपैकी एकाची एकाग्रता जास्त असते आणि दुसऱ्यामध्ये कमी एकाग्रता असते, परिणामी कमी-कार्यक्षमता असममित प्रवर्धन होते.

प्रतिकारक उपाय आहेत:

① चांगले प्राइमर सिंथेसिस युनिट निवडा.

② प्राइमर्सची एकाग्रता केवळ OD मूल्याकडेच पाहत नाही, तर ॲग्रोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसीससाठी प्राइमर स्टॉक सोल्यूशनकडे देखील लक्ष दिले पाहिजे. प्राइमर बँड असणे आवश्यक आहे आणि दोन प्राइमर बँडची चमक अंदाजे समान असावी. उदाहरणार्थ, एका प्राइमरला बँड असतो आणि दुसऱ्या प्राइमरला बँड नसतो. स्ट्रिप्ससाठी, यावेळी पीसीआर अयशस्वी होऊ शकतो आणि प्राइमर सिंथेसिस युनिटसह वाटाघाटीद्वारे निराकरण केले पाहिजे. जर एका प्राइमरमध्ये जास्त ब्राइटनेस असेल आणि दुसऱ्याची ब्राइटनेस कमी असेल, तर प्राइमर्स पातळ करताना एकाग्रता संतुलित करा.

③ वारंवार गोठणे आणि विरघळणे किंवा रेफ्रिजरेटरमध्ये दीर्घकालीन साठवण टाळण्यासाठी प्राइमर्स उच्च एकाग्रता आणि कमी प्रमाणात साठवले पाहिजेत, ज्यामुळे प्राइमर्स खराब होऊ शकतात आणि खराब होऊ शकतात.

④प्राइमरची रचना अवास्तव आहे, जसे की प्राइमरची लांबी पुरेशी नाही, प्राइमर्समध्ये डायमर तयार होतात इ. जर एकाग्रता खूप जास्त असेल तर ते पीसीआर प्रवर्धनाची विशिष्टता कमी करू शकते. जर एकाग्रता खूप कमी असेल, तर ते PCR प्रवर्धन उत्पन्नावर परिणाम करेल आणि PCR ॲम्प्लीफिकेशन बँड वाढविल्याशिवाय अपयशी ठरेल. रिॲक्शन व्हॉल्यूममधील बदल: सामान्यतः PCR ॲम्प्लीफिकेशनसाठी वापरलेले व्हॉल्यूम 20ul, 30ul आणि 50ul असतात. किंवा 100ul, PCR प्रवर्धनासाठी कोणते व्हॉल्यूम वापरावे हे वैज्ञानिक संशोधन आणि क्लिनिकल चाचणीच्या विविध उद्देशांनुसार सेट केले जाते. 20ul सारखा लहान व्हॉल्यूम बनवल्यानंतर आणि नंतर मोठा व्हॉल्यूम बनवल्यानंतर, तुम्ही अटींचे पालन केले पाहिजे, अन्यथा ते सहजपणे अयशस्वी होईल. शारीरिक कारणे: पीसीआर प्रवर्धनासाठी विकृतीकरण खूप महत्त्वाचे आहे. विकृतीकरण तापमान कमी असल्यास आणि विकृतीकरण वेळ कमी असल्यास, खोटे नकारात्मक होण्याची शक्यता असते; एनीलिंग तापमान खूप कमी आहे, ज्यामुळे विशिष्ट नसलेले प्रवर्धन होऊ शकते आणि विशिष्ट प्रवर्धन कार्यक्षमता कमी होऊ शकते. एनीलिंग तापमान खूप जास्त आहे. प्राइमर्सच्या टेम्पलेट्सच्या बंधनावर जास्त परिणाम करते आणि PCR प्रवर्धन कार्यक्षमता कमी करते. काहीवेळा ॲम्प्लीफायर किंवा पाण्यात विरघळणाऱ्या भांड्यात विकृतीकरण, ॲनिलिंग आणि विस्ताराचे तापमान तपासण्यासाठी मानक थर्मामीटर वापरणे आवश्यक असते. पीसीआर निकामी होण्याचे हे देखील एक कारण आहे. लक्ष्य क्रम भिन्नता: लक्ष्य क्रम बदलला किंवा हटविला गेला असेल, ज्यामुळे प्राइमरच्या टेम्पलेटच्या विशिष्ट बंधनावर परिणाम होतो, किंवा लक्ष्य अनुक्रमातील विशिष्ट विभाग हटविल्यामुळे प्राइमर आणि टेम्पलेट पूरक अनुक्रम गमावतात, पीसीआर प्रवर्धन यशस्वी होणार नाही.

2.फॉल्स पॉझिटिव्ह दिसणारा PCR ॲम्प्लीफिकेशन बँड लक्ष्य क्रम बँडशी सुसंगत असतो आणि काहीवेळा बँड अधिक व्यवस्थित आणि उजळ असतो. अयोग्य प्राइमर डिझाइन: निवडलेल्या ॲम्प्लीफिकेशन सीक्वेन्समध्ये लक्ष्य नसलेल्या ॲम्प्लीफिकेशन सीक्वेन्ससह एकरूपता असते, त्यामुळे PCR ॲम्प्लीफिकेशन करत असताना, ॲम्प्लीफाइड PCR उत्पादन हा लक्ष्य नसलेला क्रम असतो. लक्ष्य क्रम खूप लहान असल्यास किंवा प्राइमर खूप लहान असल्यास, चुकीचे सकारात्मक सहजपणे येऊ शकतात. प्राइमर्स पुन्हा डिझाइन करणे आवश्यक आहे. लक्ष्य अनुक्रम किंवा प्रवर्धन उत्पादनांचे क्रॉस-दूषित होणे: या दूषिततेची दोन कारणे आहेत: प्रथम, संपूर्ण जीनोम किंवा मोठ्या तुकड्यांचे क्रॉस-दूषित होणे, ज्यामुळे खोटे सकारात्मक परिणाम होतात. हे खोटे सकारात्मक खालील पद्धतींनी सोडवले जाऊ शकते: लक्ष्य क्रम सॅम्पल गनमध्ये शोषला जाऊ नये किंवा सेंट्रीफ्यूज ट्यूबमधून बाहेर पडू नये म्हणून कार्य करताना सावधगिरी बाळगा. एंजाइम आणि पदार्थ वगळता जे उच्च तापमानाचा सामना करू शकत नाहीत, सर्व अभिकर्मक किंवा उपकरणे उच्च दाबाने निर्जंतुक केली पाहिजेत. सर्व सेंट्रीफ्यूज ट्यूब आणि नमुना इंजेक्शन पिपेट टिपा एकदाच वापरल्या पाहिजेत. आवश्यक असल्यास, उपस्थित न्यूक्लिक ॲसिड नष्ट करण्यासाठी नमुना जोडण्यापूर्वी प्रतिक्रिया ट्यूब आणि अभिकर्मक अल्ट्राव्हायोलेट प्रकाशाने विकिरणित केले जातात. दुसरे म्हणजे हवेतील न्यूक्लिक ॲसिडच्या लहान तुकड्यांचे दूषित होणे. हे लहान तुकडे लक्ष्य अनुक्रमापेक्षा लहान आहेत, परंतु त्यांना विशिष्ट समरूपता आहे. ते एकमेकांशी जोडले जाऊ शकतात आणि प्राइमर्सला पूरक झाल्यानंतर, पीसीआर उत्पादने वाढवता येतात, परिणामी खोटे सकारात्मक परिणाम होतात, जे नेस्टेड पीसीआर पद्धतींनी कमी किंवा काढून टाकले जाऊ शकतात.

 

3.नॉन-स्पेसिफिक एम्प्लिफिकेशन बँड दिसतात PCR ॲम्प्लीफिकेशन नंतर दिसणारे बँड अपेक्षित आकाराशी विसंगत असतात, एकतर मोठे किंवा लहान, किंवा दोन्ही विशिष्ट ॲम्प्लीफिकेशन बँड आणि नॉन-विशिष्ट ॲम्प्लिफिकेशन बँड एकाच वेळी दिसतात. नॉन-विशिष्ट बँड दिसण्याची कारणे आहेत: प्रथम, प्राइमर्स लक्ष्य अनुक्रमास पूर्णपणे पूरक नसतात किंवा प्राइमर्स एकत्रितपणे डायमर तयार करतात. दुसरे कारण म्हणजे Mg2+ आयन एकाग्रता खूप जास्त आहे, ॲनिलिंग तापमान खूप कमी आहे आणि PCR चक्रांची संख्या खूप जास्त आहे. दुसरा घटक म्हणजे एन्झाइमची गुणवत्ता आणि प्रमाण. काही स्त्रोतांकडील एन्झाईम्स बहुधा विशिष्ट नसलेल्या बँड्ससाठी प्रवण असतात परंतु इतर स्त्रोतांकडील एन्झाईम्स तसे करत नाहीत. एन्झाईम्सच्या अति प्रमाणात काहीवेळा गैर-विशिष्ट प्रवर्धन होऊ शकते. प्रतिकारक उपायांमध्ये हे समाविष्ट आहे: आवश्यक असल्यास प्राइमर्स पुन्हा डिझाइन करा. एंजाइमचे प्रमाण कमी करा किंवा दुसर्या स्त्रोतासह बदला. प्राइमर्सचे प्रमाण कमी करा, टेम्पलेटचे प्रमाण योग्यरित्या वाढवा आणि सायकलची संख्या कमी करा. एनीलिंग तापमान योग्यरित्या वाढवा किंवा दोन-तापमान बिंदू पद्धत वापरा (93 डिग्री सेल्सिअसवर विकृतीकरण, एनीलिंग आणि 65 डिग्री सेल्सियसच्या आसपास विस्तार).

 

4. फ्लॅकी ड्रॅग किंवा स्मीअर्स दिसतात पीसीआर ॲम्प्लीफिकेशन कधीकधी स्मीअर बँड, शीट सारखी बँड किंवा कार्पेट सारखी बँड म्हणून दिसते. कारणे अनेकदा खूप जास्त एन्झाइम किंवा एन्झाईमची खराब गुणवत्ता, खूप जास्त dNTP एकाग्रता, खूप जास्त Mg2+ एकाग्रता, खूप कमी ॲनिलिंग तापमान आणि खूप चक्रे यामुळे होतात. प्रतिकारक उपायांमध्ये हे समाविष्ट आहे: ① एंझाइमचे प्रमाण कमी करा किंवा एंझाइम दुसऱ्या स्त्रोताने बदला. ②dNTP ची एकाग्रता कमी करा. योग्यरित्या Mg2+ एकाग्रता कमी करा. टेम्पलेट्सची संख्या वाढवा आणि चक्रांची संख्या कमी करा