ПГУ-ын түгээмэл асуултууд 1. Хуурамч сөрөг, олшруулах зурвас гарч ирэхгүй 2. Хуурамч эерэг 3. Өсгөлтийн өвөрмөц бус зурвас гарч ирнэ 4. Хувгарсан тууз эсвэл түрхлэг гарч ирнэ:

1Худал сөрөг, олшруулсан зурвас харагдахгүй байна ПГУ-ын урвалын гол талууд нь

① загвар нуклейн хүчил бэлтгэх

② праймерын чанар ба онцлог

③ ферментийн чанар ба

④ ПГУ-ын мөчлөгийн нөхцөл. Шалтгааныг олохын тулд дээрх холбоосууд дээр дүн шинжилгээ, судалгаа хийх хэрэгтэй.

Загвар:

① Загвар нь хольцын уураг агуулдаг

② Загвар нь Taq ферментийн дарангуйлагч агуулсан

③ Загвар дахь уурагууд, ялангуяа хромосом дахь гистонууд шингэж, арилдаггүй.

④ Загварыг гаргаж авах, бэлтгэх явцад хэт их зүйл алдсан, эсвэл фенолоор амьсгалсан

⑤Загвар нуклейн хүчил нь бүрэн денатуртлагдаагүй. Фермент болон праймерын чанар сайн байвал олшруулах зурвас гарч ирэхгүй бол сорьцыг задлах процесс эсвэл загвар нуклейн хүчлийг ялгах процесст ямар нэг зүйл буруу байх магадлалтай. Тиймээс үр дүнтэй, тогтвортой хоол боловсруулах уусмал бэлтгэх ёстой бөгөөд процедурыг засч, хүссэнээр өөрчлөх ёсгүй. . Ферментийг идэвхгүйжүүлэх: Шинэ ферментийг солих эсвэл хуучин болон шинэ ферментийг нэгэн зэрэг ашиглах шаардлагатай бөгөөд ферментийн үйл ажиллагаа алдагдсан эсвэл хангалтгүйгээс хуурамч сөрөг нөлөөлөл үүссэн эсэхийг шинжлэх шаардлагатай. Заримдаа Taq ферментийг мартдаг гэдгийг тэмдэглэх нь зүйтэй. Праймерууд: Праймерын чанар, праймерын концентраци, хоёр праймерын концентраци нь тэгш хэмтэй эсэх нь ПГУ-ын бүтэлгүйтлийн нийтлэг шалтгаан эсвэл олшруулах зурвас хангалтгүй, тархалт хялбар байдаг. Зарим багцад праймерын синтезийн чанарт асуудал гардаг. Хоёр праймерын нэг нь өндөр концентрацитай, нөгөө нь бага концентрацитай байдаг тул үр ашиг багатай тэгш бус олшруулалтыг бий болгодог.

Эсрэг арга хэмжээ нь:

① Сайн праймер синтезийн нэгжийг сонго.

② Праймерын концентраци нь зөвхөн OD-ийн утгыг харахаас гадна агароз гель электрофорезийн праймерын нөөцийн уусмалыг анхаарч үзэх хэрэгтэй. Праймер тууз байх ёстой бөгөөд хоёр праймер туузны тод байдал нь ойролцоогоор ижил байх ёстой. Жишээлбэл, нэг праймер нь туузтай, нөгөө праймер нь туузгүй байдаг. Туузны хувьд ПГУ нь энэ үед бүтэлгүйтэж болзошгүй тул праймер синтезийн нэгжтэй хэлэлцээр хийх замаар шийдвэрлэх шаардлагатай. Хэрэв нэг праймер өндөр гэрэлтэй, нөгөө нь бага гэрэлтэй бол праймерыг шингэлэх үед концентрацийг тэнцвэржүүлнэ.

③ Праймерыг дахин хөлдөөх, гэсгээх, хөргөгчинд удаан хугацаагаар хадгалахаас урьдчилан сэргийлэхийн тулд өндөр концентрацитай, бага хэмжээгээр хадгална.

④Праймерын загвар нь үндэслэлгүй, тухайлбал, праймерын урт хангалтгүй, праймеруудын хооронд димер үүсдэг гэх мэт. Mg2+ концентраци: Mg2+ ионы концентраци нь ПГУ-ын олшруулалтын үр ашигт ихээхэн нөлөөлдөг. Хэрэв концентраци хэт өндөр байвал энэ нь ПГУ-ын олшруулалтын өвөрмөц байдлыг бууруулж болно. Хэрэв концентраци хэт бага байвал энэ нь ПГУ-ын олшруулалтын гарцад нөлөөлж, тэр ч байтугай туузыг өсгөхгүйгээр ПГУ-ын олшруулалт амжилтгүй болоход хүргэдэг. Урвалын эзлэхүүний өөрчлөлт: ПГУ-ын олшруулахад ихэвчлэн 20ул, 30ул, 50ул хэмжээтэй байдаг. Эсвэл 100ul, ПГУ-ын олшруулалтад ямар эзэлхүүнийг ашиглахыг шинжлэх ухааны судалгаа, эмнэлзүйн туршилтын янз бүрийн зорилгын дагуу тогтоодог. 20ul гэх мэт бага хэмжээний эзэлхүүнийг хийж, дараа нь илүү их хэмжээгээр хийсний дараа та нөхцөлийг дагаж мөрдөх ёстой, эс тэгвээс энэ нь амархан бүтэлгүйтэх болно. Физик шалтгаан: ПГУ-ын олшруулалтад денатураци маш чухал. Хэрэв денатурацийн температур бага, денатурацийн хугацаа богино бол хуурамч сөрөг гарах магадлал маш өндөр; зөөлрүүлэх температур хэт бага байгаа нь өвөрмөц бус өсгөлт үүсгэж, тодорхой өсгөлтийн үр ашгийг бууруулдаг. Хатаах температур хэт өндөр байна. Энэ нь праймерыг загварт холбоход ихээхэн нөлөөлж, ПГУ-ын олшруулалтын үр ашгийг бууруулдаг. Заримдаа өсгөгч эсвэл усанд уусдаг саванд денатураци, анивчих, сунгах температурыг шалгахын тулд стандарт термометр ашиглах шаардлагатай байдаг. Энэ нь ПГУ-ын бүтэлгүйтлийн нэг шалтгаан юм. Зорилтот дарааллын өөрчлөлт: Хэрэв зорилтот дараалал мутацид орсон эсвэл устгагдсан бол энэ нь праймерыг загвартай холбоход нөлөөлдөг, эсвэл зорилтот дарааллын тодорхой хэсгийг устгасны улмаас праймер болон загвар нь нэмэлт дарааллыг алдвал ПГУ-ын олшруулалт амжилтанд хүрэхгүй.

2.худал эерэг Гарч буй ПГУ-ын олшруулалтын зурвас нь зорилтот дарааллын зурвастай нийцэж байгаа бөгөөд заримдаа тууз нь илүү эмх цэгцтэй, илүү гэрэл гэгээтэй байдаг. Тохиромжгүй праймерын загвар: Сонгосон олшруулалтын дараалал нь зорилтот бус өсгөлтийн дараалалтай ижил төстэй байдаг тул ПГУ-ын олшруулалтыг хийх үед олшруулсан ПГУ-ын бүтээгдэхүүн нь зорилтот бус дараалал байна. Хэрэв зорилтот дараалал хэтэрхий богино эсвэл праймер хэт богино байвал худал эерэг үр дүн гарч болно. Праймеруудыг дахин боловсруулах шаардлагатай. Зорилтот дараалал эсвэл олшруулалтын бүтээгдэхүүний хөндлөн бохирдол: Энэ бохирдлын хоёр шалтгаан бий: Нэгдүгээрт, бүх геном эсвэл том хэсгүүдийн хөндлөн бохирдол нь хуурамч эерэг үр дүнд хүргэдэг. Энэхүү худал эерэгийг дараах аргуудаар шийдэж болно: Үйл ажиллагаа явуулахдаа зорилтот дарааллыг дээжийн буу руу сорох эсвэл центрифугийн хоолойноос цацагдахаас сэргийлж болгоомжтой, болгоомжтой байгаарай. Өндөр температурыг тэсвэрлэх чадваргүй фермент, бодисоос бусад бүх урвалж, төхөөрөмжийг өндөр даралтаар ариутгана. Центрифугийн бүх хоолой болон дээжийн тарилгын пипеткийн үзүүрийг нэг удаа хэрэглэнэ. Шаардлагатай бол нуклейн хүчлийг устгахын тулд сорьцыг нэмэхийн өмнө урвалын хоолой ба урвалжуудыг хэт ягаан туяагаар цацруулна. Хоёр дахь нь агаар дахь нуклейн хүчлийн жижиг хэсгүүдийн бохирдол юм. Эдгээр жижиг хэсгүүд нь зорилтот дарааллаас богино боловч тодорхой ижил төстэй шинж чанартай байдаг. Тэдгээрийг хооронд нь холбож, праймеруудад нэмэлт болсны дараа ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг олшруулж, хуурамч эерэг үр дүнд хүргэдэг бөгөөд үүнийг үүрлэсэн ПГУ-ын аргаар багасгаж эсвэл арилгаж болно.

 

3.Өвөрмөц бус олшруулалтын зурвасууд гарч ирнэ ПГУ-ын олшруулалтын дараа гарч ирэх зурвасууд нь хүлээгдэж буй хэмжээтэй нийцэхгүй, том эсвэл бага аль аль нь эсвэл тодорхой олшруулах зурвас ба өвөрмөц бус өсгөлтийн зурвас хоёулаа нэгэн зэрэг гарч ирнэ. Өвөрмөц бус тууз үүсэх шалтгаанууд нь: нэгдүгээрт, праймерууд нь зорилтот дарааллыг бүрэн нөхдөггүй, эсвэл праймерууд нэгтгэж димер үүсгэдэг. Хоёрдахь шалтгаан нь Mg2+ ионы концентраци хэт өндөр, нөхөх температур хэт бага, ПГУ-ын циклийн тоо хэт өндөр байна. Хоёрдахь хүчин зүйл бол ферментийн чанар, тоо хэмжээ юм. Зарим эх үүсвэрийн ферментүүд нь өвөрмөц бус зурваст өртөмтгий байдаг ч бусад эх үүсвэрийн ферментүүд тийм биш юм. Хэт их хэмжээний ферментүүд нь заримдаа өвөрмөц бус олшроход хүргэдэг. Эсрэг арга хэмжээ нь: шаардлагатай бол праймерыг дахин төлөвлөх. Ферментийн хэмжээг багасгах эсвэл өөр эх үүсвэрээр солино. Праймерын хэмжээг багасгаж, загварын хэмжээг зохих ёсоор нэмэгдүүлж, мөчлөгийн тоог бууруулна. Хатаах температурыг зохих ёсоор нэмэгдүүлэх эсвэл хоёр температурын цэгийн аргыг ашиглана уу (93 ° C-д денатураци хийх, 65 ° C-д үржүүлэх, сунгах).

 

4.Хэвэршсэн чирэгдэл эсвэл түрхэц гарч ирдэг ПГУ-ын олшруулалт нь заримдаа түрхсэн тууз, хуудас шиг тууз эсвэл хивс шиг тууз хэлбэрээр илэрдэг. Шалтгаан нь ихэвчлэн хэт их фермент эсвэл чанар муутай, dNTP-ийн хэт өндөр концентраци, хэт өндөр Mg2+ концентраци, хэт бага ханиалгах температур, хэт олон циклээс үүдэлтэй байдаг. Эсрэг арга хэмжээнд: ① Ферментийн хэмжээг багасгах эсвэл ферментийг өөр эх үүсвэрээр солих. ②dNTP-ийн концентрацийг бууруулна. Mg2+ концентрацийг зохих ёсоор бууруулна. Загваруудын хэмжээг нэмэгдүүлж, мөчлөгийн тоог бууруулна