PCR പതിവുചോദ്യങ്ങൾ 1. തെറ്റായ നെഗറ്റീവ്, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡ് ദൃശ്യമാകില്ല 2. തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് 3. നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യമാകുന്നു 4. ഫ്ലേക്കി ഡ്രാഗ് സ്ട്രിപ്പുകൾ അല്ലെങ്കിൽ സ്മിയർ സ്ട്രിപ്പുകൾ ദൃശ്യമാകുന്നു:

1 തെറ്റായ നെഗറ്റീവ്, ആംപ്ലിഫൈഡ് ബാൻഡ് ദൃശ്യമാകുന്നില്ല PCR പ്രതികരണത്തിൻ്റെ പ്രധാന വശങ്ങൾ

① ടെംപ്ലേറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് തയ്യാറാക്കൽ

② പ്രൈമർ ഗുണനിലവാരവും പ്രത്യേകതയും

③ എൻസൈം ഗുണനിലവാരവും

④ PCR സൈക്കിൾ വ്യവസ്ഥകൾ. കാരണങ്ങൾ കണ്ടെത്തുന്നതിന്, മുകളിലുള്ള ലിങ്കുകളിൽ വിശകലനവും ഗവേഷണവും നടത്തണം.

ടെംപ്ലേറ്റ്:

① ടെംപ്ലേറ്റിൽ അശുദ്ധമായ പ്രോട്ടീനുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു

② ടെംപ്ലേറ്റിൽ Taq എൻസൈം ഇൻഹിബിറ്ററുകൾ അടങ്ങിയിരിക്കുന്നു

③ ടെംപ്ലേറ്റിലെ പ്രോട്ടീനുകൾ ദഹിപ്പിക്കപ്പെടുകയും നീക്കം ചെയ്യപ്പെടുകയും ചെയ്യുന്നില്ല, പ്രത്യേകിച്ച് ക്രോമസോമുകളിലെ ഹിസ്റ്റോണുകൾ

④ ടെംപ്ലേറ്റ് വേർതിരിച്ചെടുക്കുമ്പോഴും തയ്യാറാക്കുമ്പോഴും വളരെയധികം നഷ്ടപ്പെട്ടു, അല്ലെങ്കിൽ ഫിനോൾ ശ്വസിച്ചു

⑤ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് ടെംപ്ലേറ്റ് പൂർണ്ണമായും ഡീനാച്ചർ ചെയ്തിട്ടില്ല. എൻസൈമുകളുടെയും പ്രൈമറുകളുടെയും ഗുണനിലവാരം നല്ലതായിരിക്കുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യമാകുന്നില്ലെങ്കിൽ, മാതൃകയുടെ ദഹനപ്രക്രിയയിലോ ടെംപ്ലേറ്റ് ന്യൂക്ലിക് ആസിഡ് വേർതിരിച്ചെടുക്കൽ പ്രക്രിയയിലോ എന്തെങ്കിലും തെറ്റ് സംഭവിക്കാൻ സാധ്യതയുണ്ട്. അതിനാൽ, ഫലപ്രദവും സുസ്ഥിരവുമായ ദഹന പരിഹാരം തയ്യാറാക്കണം, നടപടിക്രമം ശരിയാക്കണം, ഇഷ്ടാനുസരണം മാറ്റരുത്. . എൻസൈം നിർജ്ജീവമാക്കൽ: പുതിയ എൻസൈം മാറ്റിസ്ഥാപിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്, അല്ലെങ്കിൽ ഒരേ സമയം പഴയതും പുതിയതുമായ എൻസൈമുകൾ ഉപയോഗിച്ച് തെറ്റായ നെഗറ്റീവുകൾ നഷ്ടപ്പെടുന്നത് അല്ലെങ്കിൽ അപര്യാപ്തമായ എൻസൈമിൻ്റെ പ്രവർത്തനമാണോ എന്ന് വിശകലനം ചെയ്യാൻ ആവശ്യമാണ്. ചില സമയങ്ങളിൽ ടാക് എൻസൈം മറന്നു പോകും. ചില ബാച്ചുകളിൽ പ്രൈമർ സിന്തസിസിൻ്റെ ഗുണനിലവാരത്തിൽ പ്രശ്നങ്ങളുണ്ട്. രണ്ട് പ്രൈമറുകളിൽ ഒന്നിന് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയും മറ്റൊന്നിന് കുറഞ്ഞ സാന്ദ്രതയുമുണ്ട്, ഇത് കുറഞ്ഞ കാര്യക്ഷമതയുള്ള അസമമായ ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി മാറുന്നു.

പ്രതിരോധ നടപടികൾ ഇവയാണ്:

① ഒരു നല്ല പ്രൈമർ സിന്തസിസ് യൂണിറ്റ് തിരഞ്ഞെടുക്കുക.

② പ്രൈമറുകളുടെ സാന്ദ്രത OD മൂല്യം നോക്കുക മാത്രമല്ല, അഗറോസ് ജെൽ ഇലക്ട്രോഫോറെസിസിനുള്ള പ്രൈമർ സ്റ്റോക്ക് സൊല്യൂഷനിലേക്ക് ശ്രദ്ധിക്കുകയും വേണം. പ്രൈമർ ബാൻഡുകൾ ഉണ്ടായിരിക്കണം, രണ്ട് പ്രൈമർ ബാൻഡുകളുടെയും തെളിച്ചം ഏകദേശം തുല്യമായിരിക്കണം. ഉദാഹരണത്തിന്, ഒരു പ്രൈമറിന് ഒരു ബാൻഡ് ഉണ്ട്, മറ്റേ പ്രൈമറിന് ബാൻഡ് ഇല്ല. സ്ട്രിപ്പുകൾക്കായി, ഈ സമയത്ത് PCR പരാജയപ്പെടാം, പ്രൈമർ സിന്തസിസ് യൂണിറ്റുമായുള്ള ചർച്ചയിലൂടെ പരിഹരിക്കണം. ഒരു പ്രൈമറിന് ഉയർന്ന തെളിച്ചവും മറ്റൊന്നിന് കുറഞ്ഞ തെളിച്ചവുമുണ്ടെങ്കിൽ, പ്രൈമറുകൾ നേർപ്പിക്കുമ്പോൾ സാന്ദ്രത സന്തുലിതമാക്കുക.

③ പ്രൈമറുകൾ ആവർത്തിച്ച് ഫ്രീസുചെയ്യുന്നതും ഉരുകുന്നതും അല്ലെങ്കിൽ ഫ്രിഡ്ജിൽ ദീർഘകാല സംഭരണവും തടയുന്നതിന് ഉയർന്ന സാന്ദ്രതയിലും ചെറിയ അളവിലും സൂക്ഷിക്കണം, ഇത് പ്രൈമറുകളുടെ അപചയത്തിനും നശീകരണത്തിനും ഇടയാക്കും.

④ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ യുക്തിരഹിതമാണ്, പ്രൈമർ ദൈർഘ്യം പോരാ, പ്രൈമറുകൾക്കിടയിൽ ഡൈമറുകൾ രൂപപ്പെടുന്നു മുതലായവ. Mg2+ കോൺസൺട്രേഷൻ: Mg2+ അയോൺ കോൺസൺട്രേഷൻ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമതയിൽ വലിയ സ്വാധീനം ചെലുത്തുന്നു. സാന്ദ്രത വളരെ ഉയർന്നതാണെങ്കിൽ, അത് പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ്റെ പ്രത്യേകത കുറയ്ക്കും. കോൺസൺട്രേഷൻ വളരെ കുറവാണെങ്കിൽ, അത് PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വിളവിനെ ബാധിക്കുകയും ബാൻഡുകൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാതെ PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ പരാജയപ്പെടുകയും ചെയ്യും. പ്രതികരണ വോളിയത്തിലെ മാറ്റങ്ങൾ: സാധാരണയായി PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി ഉപയോഗിക്കുന്ന വോള്യങ്ങൾ 20ul, 30ul, 50ul എന്നിവയാണ്. അല്ലെങ്കിൽ 100ul, ശാസ്ത്രീയ ഗവേഷണത്തിൻ്റെയും ക്ലിനിക്കൽ പരിശോധനയുടെയും വ്യത്യസ്ത ഉദ്ദേശ്യങ്ങൾക്കനുസരിച്ച് PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനായി എന്ത് വോളിയം ഉപയോഗിക്കണം. 20ul പോലെയുള്ള ഒരു ചെറിയ വോളിയം ഉണ്ടാക്കിയ ശേഷം ഒരു വലിയ വോളിയം ഉണ്ടാക്കിയ ശേഷം, നിങ്ങൾ വ്യവസ്ഥകൾ പാലിക്കണം, അല്ലാത്തപക്ഷം അത് എളുപ്പത്തിൽ പരാജയപ്പെടും. ശാരീരിക കാരണങ്ങൾ: പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷന് ഡിനാറ്ററേഷൻ വളരെ പ്രധാനമാണ്. ഡിനാറ്ററേഷൻ താപനില കുറവാണെങ്കിൽ, ഡിനാറ്ററേഷൻ സമയം കുറവാണെങ്കിൽ, തെറ്റായ നിഷേധങ്ങൾ ഉണ്ടാകാനുള്ള സാധ്യത വളരെ കൂടുതലാണ്; അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ്, ഇത് നിർദ്ദിഷ്ടമല്ലാത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷനു കാരണമാകുകയും നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യും. അനീലിംഗ് താപനില വളരെ ഉയർന്നതാണ്. ടെംപ്ലേറ്റുകളിലേക്കുള്ള പ്രൈമറുകളുടെ ബൈൻഡിംഗിനെ വളരെയധികം ബാധിക്കുകയും PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ കാര്യക്ഷമത കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുന്നു. ആംപ്ലിഫയർ അല്ലെങ്കിൽ വെള്ളത്തിൽ ലയിക്കുന്ന പാത്രത്തിലെ ഡീനാറ്ററേഷൻ, അനീലിംഗ്, എക്സ്റ്റൻഷൻ താപനില എന്നിവ പരിശോധിക്കാൻ ചിലപ്പോൾ ഒരു സാധാരണ തെർമോമീറ്റർ ഉപയോഗിക്കേണ്ടത് ആവശ്യമാണ്. ഇതും പിസിആർ പരാജയപ്പെടാനുള്ള ഒരു കാരണമാണ്. ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വേരിയേഷൻ: ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് മ്യൂട്ടേറ്റ് ചെയ്യുകയോ ഇല്ലാതാക്കുകയോ ചെയ്താൽ, ഇത് ടെംപ്ലേറ്റിലേക്കുള്ള പ്രൈമറിൻ്റെ നിർദ്ദിഷ്ട ബൈൻഡിംഗിനെ ബാധിക്കുന്നു, അല്ലെങ്കിൽ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിൻ്റെ ഒരു നിശ്ചിത സെഗ്‌മെൻ്റ് ഇല്ലാതാക്കുന്നത് കാരണം പ്രൈമറിനും ടെംപ്ലേറ്റിനും കോംപ്ലിമെൻ്ററി സീക്വൻസ് നഷ്‌ടമാകുകയാണെങ്കിൽ, പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ വിജയിക്കില്ല.

2.false പോസിറ്റീവ് ദൃശ്യമാകുന്ന PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡ് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് ബാൻഡുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നു, ചിലപ്പോൾ ബാൻഡ് കൂടുതൽ ചിട്ടയുള്ളതും തിളക്കമുള്ളതുമാണ്. അനുചിതമായ പ്രൈമർ ഡിസൈൻ: തിരഞ്ഞെടുത്ത ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സീക്വൻസിന് നോൺ-ടാർഗെറ്റ് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ സീക്വൻസുമായി ഹോമോോളജി ഉണ്ട്, അതിനാൽ പിസിആർ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ നടത്തുമ്പോൾ, ആംപ്ലിഫൈഡ് പിസിആർ ഉൽപ്പന്നം ടാർഗെറ്റ് അല്ലാത്ത ശ്രേണിയാണ്. ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വളരെ ചെറുതാണെങ്കിൽ അല്ലെങ്കിൽ പ്രൈമർ വളരെ ചെറുതാണെങ്കിൽ, തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകൾ എളുപ്പത്തിൽ സംഭവിക്കാം. പ്രൈമറുകൾ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യേണ്ടതുണ്ട്. ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുകളുടെ അല്ലെങ്കിൽ ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ഉൽപ്പന്നങ്ങളുടെ ക്രോസ്-മലിനീകരണം: ഈ മലിനീകരണത്തിന് രണ്ട് കാരണങ്ങളുണ്ട്: ആദ്യം, മുഴുവൻ ജീനോമിൻ്റെയും അല്ലെങ്കിൽ വലിയ ശകലങ്ങളുടെയും ക്രോസ്-മലിനീകരണം, തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകളിലേക്ക് നയിക്കുന്നു. ഈ തെറ്റായ പോസിറ്റീവ് ഇനിപ്പറയുന്ന രീതികളിലൂടെ പരിഹരിക്കാൻ കഴിയും: സാമ്പിൾ തോക്കിലേക്ക് ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസ് വലിച്ചെടുക്കുന്നതോ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബിൽ നിന്ന് തെറിക്കുന്നതോ തടയാൻ പ്രവർത്തിക്കുമ്പോൾ ശ്രദ്ധയും സൗമ്യതയും പുലർത്തുക. ഉയർന്ന ഊഷ്മാവ് താങ്ങാൻ കഴിയാത്ത എൻസൈമുകളും പദാർത്ഥങ്ങളും ഒഴികെ, എല്ലാ റിയാക്ടറുകളും ഉപകരണങ്ങളും ഉയർന്ന മർദ്ദം ഉപയോഗിച്ച് അണുവിമുക്തമാക്കണം. എല്ലാ സെൻട്രിഫ്യൂജ് ട്യൂബുകളും സാമ്പിൾ ഇഞ്ചക്ഷൻ പൈപ്പറ്റ് ടിപ്പുകളും ഒരിക്കൽ ഉപയോഗിക്കണം. ആവശ്യമെങ്കിൽ, ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളെ നശിപ്പിക്കുന്നതിന് മാതൃക ചേർക്കുന്നതിന് മുമ്പ് പ്രതികരണ ട്യൂബുകളും റിയാക്ടറുകളും അൾട്രാവയലറ്റ് പ്രകാശം ഉപയോഗിച്ച് വികിരണം ചെയ്യുന്നു. രണ്ടാമത്തേത് വായുവിലെ ന്യൂക്ലിക് ആസിഡുകളുടെ ചെറിയ ശകലങ്ങളുടെ മലിനീകരണമാണ്. ഈ ചെറിയ ശകലങ്ങൾ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസിനേക്കാൾ ചെറുതാണ്, പക്ഷേ ചില ഹോമോോളജി ഉണ്ട്. അവ പരസ്പരം വിഭജിക്കാം, കൂടാതെ പ്രൈമറുകൾക്ക് പൂരകമായ ശേഷം, പിസിആർ ഉൽപ്പന്നങ്ങൾ വർദ്ധിപ്പിക്കാം, ഇത് തെറ്റായ പോസിറ്റീവുകൾക്ക് കാരണമാകുന്നു, ഇത് നെസ്റ്റഡ് പിസിആർ രീതികളിലൂടെ കുറയ്ക്കുകയോ ഇല്ലാതാക്കുകയോ ചെയ്യാം.

 

3. നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകൾ ദൃശ്യമാകുന്നു PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷനുശേഷം ദൃശ്യമാകുന്ന ബാൻഡുകൾ വലുതോ ചെറുതോ ആയ പ്രതീക്ഷിച്ച വലുപ്പവുമായി പൊരുത്തപ്പെടുന്നില്ല, അല്ലെങ്കിൽ നിർദ്ദിഷ്ട ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ബാൻഡുകളും ഒരേ സമയം ദൃശ്യമാകും. നോൺ-സ്പെസിഫിക് ബാൻഡുകൾ പ്രത്യക്ഷപ്പെടാനുള്ള കാരണങ്ങൾ ഇവയാണ്: ഒന്നാമതായി, പ്രൈമറുകൾ ടാർഗെറ്റ് സീക്വൻസുമായി പൂർണ്ണമായും പൂരകമല്ല, അല്ലെങ്കിൽ ഡൈമറുകൾ രൂപപ്പെടുത്തുന്നതിന് പ്രൈമറുകൾ കൂട്ടിച്ചേർക്കുന്നു. രണ്ടാമത്തെ കാരണം, Mg2+ അയോണിൻ്റെ സാന്ദ്രത വളരെ കൂടുതലാണ്, അനീലിംഗ് താപനില വളരെ കുറവാണ്, PCR സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം വളരെ കൂടുതലാണ്. രണ്ടാമത്തെ ഘടകം എൻസൈമിൻ്റെ ഗുണനിലവാരവും അളവുമാണ്. ചില സ്രോതസ്സുകളിൽ നിന്നുള്ള എൻസൈമുകൾ പലപ്പോഴും നോൺ-സ്പെസിഫിക് ബാൻഡുകൾക്ക് സാധ്യതയുണ്ട്, എന്നാൽ മറ്റ് ഉറവിടങ്ങളിൽ നിന്നുള്ള എൻസൈമുകൾ അങ്ങനെ ചെയ്യുന്നില്ല. എൻസൈമുകളുടെ അമിതമായ അളവ് ചിലപ്പോൾ നോൺ-സ്പെസിഫിക് ആംപ്ലിഫിക്കേഷനിലേക്ക് നയിച്ചേക്കാം. പ്രതിരോധ നടപടികളിൽ ഇവ ഉൾപ്പെടുന്നു: ആവശ്യമെങ്കിൽ പ്രൈമറുകൾ പുനർരൂപകൽപ്പന ചെയ്യുക. എൻസൈമിൻ്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുക അല്ലെങ്കിൽ മറ്റൊരു ഉറവിടം ഉപയോഗിച്ച് മാറ്റിസ്ഥാപിക്കുക. പ്രൈമറുകളുടെ അളവ് കുറയ്ക്കുക, ടെംപ്ലേറ്റിൻ്റെ അളവ് ഉചിതമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക, സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുക. അനീലിംഗ് താപനില ഉചിതമായി വർദ്ധിപ്പിക്കുക അല്ലെങ്കിൽ രണ്ട്-താപനില പോയിൻ്റ് രീതി ഉപയോഗിക്കുക (93 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിൽ ഡീനാറ്ററേഷൻ, 65 ഡിഗ്രി സെൽഷ്യസിനു ചുറ്റും അനീലിംഗ്, വിപുലീകരണം).

 

4. ഫ്ലേക്കി ഡ്രാഗ് അല്ലെങ്കിൽ സ്മിയർ ദൃശ്യമാകുന്നു PCR ആംപ്ലിഫിക്കേഷൻ ചിലപ്പോൾ സ്മിയർ ബാൻഡുകളോ ഷീറ്റ് പോലുള്ള ബാൻഡുകളോ പരവതാനി പോലുള്ള ബാൻഡുകളോ ആയി കാണപ്പെടുന്നു. വളരെയധികം എൻസൈം അല്ലെങ്കിൽ എൻസൈമിൻ്റെ മോശം ഗുണനിലവാരം, വളരെ ഉയർന്ന dNTP കോൺസൺട്രേഷൻ, വളരെ ഉയർന്ന Mg2+ സാന്ദ്രത, വളരെ കുറഞ്ഞ അനീലിംഗ് താപനില, വളരെയധികം ചക്രങ്ങൾ എന്നിവയാണ് കാരണങ്ങൾ. പ്രതിരോധ നടപടികളിൽ ഇവ ഉൾപ്പെടുന്നു: ① എൻസൈമിൻ്റെ അളവ് കുറയ്ക്കുക, അല്ലെങ്കിൽ എൻസൈമിന് പകരം മറ്റൊരു ഉറവിടം നൽകുക. ②dNTP യുടെ സാന്ദ്രത കുറയ്ക്കുക. Mg2+ സാന്ദ്രത ഉചിതമായി കുറയ്ക്കുക. ടെംപ്ലേറ്റുകളുടെ അളവ് വർദ്ധിപ്പിക്കുകയും സൈക്കിളുകളുടെ എണ്ണം കുറയ്ക്കുകയും ചെയ്യുക