ПЦР ЧПП 1. Лажно негативни, не се појавува лента за засилување 2. Лажно позитивно 3. Се појавуваат неспецифични ленти за засилување 4. Се појавуваат ронливи ленти за влечење или размачкување:

1Лажно негативно, не се појавува засилена лента Клучните аспекти на PCR реакцијата се

① подготовка на шаблон нуклеинска киселина

② квалитет и специфичност на прајмерот

③ ензимски квалитет и

④ PCR циклус услови. За да се пронајдат причините, треба да се направат и анализи и истражувања на горните линкови.

Шаблон:

① Шаблонот содржи протеини од нечистотија

② Шаблонот содржи Taq ензимски инхибитори

③ Протеините во шаблонот не се вари и не се отстрануваат, особено хистоните во хромозомите

④ За време на екстракцијата и подготовката на шаблонот се изгубило премногу, или бил вдишан фенол

⑤ Шаблонот нуклеинска киселина не е целосно денатурирана. Кога квалитетот на ензимите и прајмерите е добар, доколку не се појават лентите за засилување, најверојатно нешто не е во ред со процесот на варење на примерокот или со процесот на екстракција на нуклеинската киселина на шаблонот. Затоа, мора да се подготви ефективно и стабилно решение за варење, а постапката да се поправи и да не се менува по желба. . Ензимска инактивација: Неопходно е да се замени новиот ензим или да се користат и старите и новите ензими во исто време за да се анализира дали лажните негативни резултати се предизвикани од загуба или недоволна ензимска активност. Треба да се напомене дека понекогаш се заборава ензимот Taq. Прајмери: Квалитетот на прајмерот, концентрацијата на прајмерот и дали концентрациите на двата прајмери ​​се симетрични се вообичаени причини за неуспех на PCR или незадоволителни ленти за засилување и лесна дифузија. Има проблеми со квалитетот на синтезата на прајмерот во некои серии. Еден од двата прајмери ​​има висока концентрација, а другиот има мала концентрација, што резултира со асиметрично засилување со ниска ефикасност.

Контрамерките се:

① Изберете добра единица за синтеза на прајмер.

② Концентрацијата на прајмерите не треба само да ја гледа вредноста на OD, туку треба да обрне внимание и на растворот за прајмер за електрофореза на гел агароза. Мора да има ленти за прајмер, а осветленоста на двете прајмерни ленти треба да биде приближно иста. На пример, еден прајмер има лента, а другиот прајмер нема лента. За ленти, PCR може да не успее во овој момент и треба да се реши преку преговарање со единицата за синтеза на прајмер. Ако еден прајмер има висока осветленост, а другиот има мала осветленост, избалансирајте ги концентрациите при разредување на прајмерите.

③ Прајмерите треба да се чуваат во висока концентрација и мали количини за да се спречи повторното замрзнување и одмрзнување или долгорочно складирање во фрижидер, што може да доведе до влошување и деградација на прајмерите.

④ Дизајнот на прајмерот е неразумен, како на пример, должината на прајмерот не е доволна, димерите се формираат помеѓу прајмери, итн. Концентрација на Mg2+: Концентрацијата на јоните на Mg2+ има големо влијание врз ефикасноста на засилување на PCR. Ако концентрацијата е превисока, може да ја намали специфичноста на PCR засилувањето. Ако концентрацијата е премногу ниска, тоа ќе влијае на приносот на PCR засилување, па дури и ќе предизвика PCR засилување да не успее без засилување на лентите. Промени во волуменот на реакцијата: Обично волумените што се користат за PCR засилување се 20ul, 30ul и 50ul. Или 100 ул, колкав волумен треба да се користи за PCR засилување се поставува според различни цели на научно истражување и клиничко тестирање. Откако ќе направите мал волумен, како 20ул, а потоа ќе направите поголем волумен, мора да ги следите условите, во спротивно лесно ќе пропадне. Физички причини: Денатурацијата е многу важна за PCR засилување. Ако температурата на денатурација е ниска, а времето на денатурација е кратко, голема е веројатноста да се појават лажни негативи; температурата на жарење е премногу ниска, што може да предизвика неспецифично засилување и да ја намали специфичната ефикасност на засилување. Температурата на жарење е превисока. Високо влијае на врзувањето на прајмерите со шаблоните и ја намалува ефикасноста на засилување на PCR. Понекогаш е неопходно да се користи стандарден термометар за проверка на температурите на денатурација, жарење и продолжување во засилувачот или садот растворлив во вода. Ова е исто така една од причините за неуспехот на PCR. Варијација на целната секвенца: ако целната секвенца е мутирана или избришана, што влијае на специфичното врзување на прајмерот со шаблонот, или прајмерот и шаблонот ја губат комплементарната низа поради бришење на одреден сегмент од целната секвенца, засилувањето на PCR нема да биде успешна.

2. лажно позитивно Појасот за засилување на PCR што се појавува е конзистентен со опсегот на целната секвенца, а понекогаш опсегот е поуреден и посветол. Несоодветен дизајн на прајмер: Избраната секвенца за засилување има хомологија со секвенцата на нецелна засилување, така што при изведување на PCR засилување, засилениот PCR производ е нецелна секвенца. Ако целната низа е премногу кратка или прајмерот е премногу краток, лесно може да се појават лажни позитиви. Прајмерите треба да се редизајнираат. Вкрстена контаминација на целните секвенци или производи за засилување: Постојат две причини за оваа контаминација: Прво, вкрстена контаминација на целиот геном или големи фрагменти, што доведува до лажни позитиви. Овој лажен позитивен може да се реши со следниве методи: Бидете внимателни и нежни кога работите за да спречите целната секвенца да се вшмука во пиштолот за примерок или да се испрска надвор од цевката за центрифуга. Освен за ензими и супстанции кои не можат да издржат високи температури, сите реагенси или опрема треба да се стерилизираат со висок притисок. Сите цевки за центрифугирање и пипети за инјектирање примероци треба да се користат еднаш. Доколку е потребно, реакционите цевки и реагенсите се озрачуваат со ултравиолетова светлина пред да се додаде примерокот за да се уништат присутните нуклеински киселини. Втората е контаминација на мали фрагменти од нуклеински киселини во воздухот. Овие мали фрагменти се пократки од целната низа, но имаат одредена хомологија. Тие може да се спојат еден со друг, а откако ќе бидат комплементарни со прајмерите, производите на PCR може да се засилат, што резултира со лажни позитиви, кои може да се намалат или елиминираат со вгнездени PCR методи.

 

3. Се појавуваат неспецифични опсези за засилување Појасите што се појавуваат по PCR засилувањето се неконзистентни со очекуваната големина, или поголеми или помали, или истовремено се појавуваат и двете специфични опсези за засилување и неспецифичните опсези на засилување. Причините за појавата на неспецифични ленти се: прво, прајмерите не се целосно комплементарни со целната низа или прајмерите се агрегираат за да формираат димери. Втората причина е што концентрацијата на јоните на Mg2+ е превисока, температурата на жарење е премногу ниска, а бројот на циклуси на PCR е превисок. Вториот фактор е квалитетот и квантитетот на ензимот. Ензимите од некои извори често се склони кон неспецифични ленти, но ензимите од други извори не. Прекумерните количини на ензими понекогаш може да доведат до неспецифично засилување. Контрамерките вклучуваат: редизајн на прајмери ​​доколку е потребно. Намалете ја количината на ензимот или заменете ја со друг извор. Намалете ја количината на прајмери, соодветно зголемете ја количината на шаблонот и намалете го бројот на циклуси. Зголемете ја температурата на жарење соодветно или користете го методот со две температурни точки (денатурација на 93°C, жарење и продолжување околу 65°C).

 

4. Се појавуваат ронливи влечења или размаски, PCR засилувањето понекогаш се појавува како размачкани ленти, ленти слични на листови или ленти слични на тепих. Причините често се предизвикани од премногу ензими или слаб квалитет на ензимот, превисока концентрација на dNTP, превисока концентрација на Mg2+, премногу ниска температура на жарење и премногу циклуси. Контрамерките вклучуваат: ① Намалете ја количината на ензимот или заменете го ензимот со друг извор. ②Намалете ја концентрацијата на dNTP. Соодветно намалете ја концентрацијата на Mg2+. Зголемете ја количината на шаблони и намалете го бројот на циклуси