PCR FAQ 1. He kino kino, karekau he roopu whakakaha ka puta 2. He pai te pai 3. Ka puta nga roopu whakakaha kore-motuhake 4. Ka puta mai nga takai toia me nga papa pani:
1He kino kino, karekau he roopu whakakaha ka puta Ko nga ahuatanga matua o te tauhohenga PCR ko
① te whakarite i te tauira waikawa nucleic
② te kounga tuatahi me te motuhake
③ kounga whākōkī me
④ Nga tikanga huringa PCR. Ki te rapu i nga take, me whakahaere ano hoki te tātari me te rangahau mo nga hononga o runga ake nei.
Tātauira:
① He pūmua poke kei roto i te tauira
② Kei roto i te tauira ko te Taq enzyme inhibitors
③ Ko nga pūmua kei roto i te tauira kaore i te keri ka tangohia, ina koa ko nga histones i roto i nga chromosomes
④ He nui rawa nga mea i ngaro i te wa o te tangohanga me te whakareri o te tauira, ka whakangoatia ranei te phenol
⑤Ko te waikawa nucleic tauira kaore i tino whakakorehia. Ina he pai te kounga o nga enzymes me nga mea tuatahi, ki te kore e puta nga roopu whakakaha, tera pea kei te he te tukanga nakunaku o te tauira, te tauira tangohanga waikawa karihi tauira ranei. No reira, me whakarite he otinga nakunaku whai hua me te pumau, me whakatika te tikanga, kaua e whakarereke i te hiahia. . Te whakakorikori i te enzyme: Me whakakapi i te whaakiki hou, te whakamahi ranei i nga whaamua tawhito me nga mea hou i te wa kotahi ki te tātari mena he aha nga kino kino i puta mai i te ngaronga, i te kore rawa ranei o te mahi whaakiki. Me mahara ko etahi wa ka warewarehia te enzyme Taq.Primers: Ko te kounga o te tuatahi, te kukū tuatahi, me te mea he hangarite nga kuhanga o nga papa tuatahi e rua he take noa mo te kore PCR, te kore pai o nga roopu whakakaha me te ngawari te horahanga. He raru kei te kounga o te whakahiato tuatahi i etahi puranga. Ko tetahi o nga mea tuatahi e rua he nui te kukū, he iti te kukū o tetehi, na te iti o te kaha o te whakakaha hangarite.
Ko nga mahi aukati ko:
① Tīpakohia he kōwae kōtuitui tuatahi pai.
② Ko te kukū o nga mea tuatahi kia kaua e titiro noa ki te uara OD, engari me aro ano hoki ki te otinga rakau tuatahi mo te hiko hiko agarose. Me whai riipene tuatahi, me te kanapa o nga roopu tuatahi e rua kia rite tonu. Hei tauira, he roopu to tetahi tuatahi, karekau he roopu o tetahi tuatahi. Mo nga takai, ka rahua pea te PCR i tenei wa, me whakatau ma te whiriwhiringa me te waeine whakahiato tuatahi. Mena he nui te kanapa o tetahi tuatahi, he iti te kanapa o tetahi, whakatauritehia nga kukū i te wa e waimeha ana i nga timatanga.
③ Me penapena nga papa tuatahi ki roto i te kukū nui me te rahinga iti kia kore ai e tukuruatia te mīti me te whakamaroke, te rokiroki mo te wa roa ranei i roto i te pouaka whakamatao, tera pea ka paheke, ka paheketanga hoki nga mea tuatahi.
④Ko te hoahoa tuatahi kaore i te tika, penei i te kore e ranea te roa o te tuatahi, ka hangaia nga dimer i waenga i nga papa tuatahi, me etahi atu. Mena he tiketike rawa te kukū, ka taea te whakaiti i te motuhake o te whakanui PCR. Mena he iti rawa te kukū, ka pa ki te hua whakakaha PCR me te kore e taea te whakakaha PCR me te kore e whakanui i nga roopu. Nga huringa i roto i te rōrahi tauhohenga: I te nuinga o te wā ko te 20ul, 30ul, me te 50ul nga pukapuka e whakamahia ana mo te whakakaha PCR. Ko te 100ul ranei, he aha te rōrahi e whakamahia ana mo te whakanui PCR kua whakaritea kia rite ki nga kaupapa rereke o te rangahau pūtaiao me te whakamatautau haumanu. I muri i te hanga i te riipene iti, penei i te 20ul, katahi ka hanga he rōrahi nui ake, me whai koe i nga tikanga, ki te kore ka taka noa. Nga take a-tinana: He mea tino nui te whakahekenga mo te whakakaha PCR. Mēnā he iti te pāmahana denaturation me te poto o te wā denaturation, ka puta pea nga kino kino; he iti rawa te pāmahana whakahiato, ka taea te whakakaha kore-motuhake me te whakaiti i te kaha whakakaha motuhake. He tiketike rawa te pāmahana whakaene. Ka tino pa ki te herenga o nga mea tuatahi ki nga tauira me te whakaiti i te kaha o te whakakaha PCR. I etahi wa me whakamahi i te inemahana paerewa hei tirotiro i te denaturation, annealing me te toronga pāmahana i roto i te whakakaha, i te kohua wairewa ranei. Koinei hoki tetahi o nga take mo te kore PCR. Te rereketanga o te raupapa whainga: Mena ka whakahurihia, ka mukua ranei te raupapa whainga, ka pa ki te herenga motuhake o te tuatahi ki te tauira, ka ngaro ranei te raupapa tuatahi me te tauira na te whakakorenga o tetahi waahanga o te raupapa whaainga, ko te whakanui PCR e kore e angitu.
2.false positive Ko te roopu whakakaha PCR ka puta he rite tonu ki te roopu raupapa whainga, i etahi wa ka pai ake, ka marama ake te roopu. Ko te hoahoa tuatahi kaore i te tika: Ko te raupapa whakakaha kua tohua he homology me te raupapa whakakaha kore-whaainga, no reira i te wa e mahia ana te whakakaha PCR, ko te hua PCR kua whakanuia he raupapa kore-whakaaro. Mena he poto rawa te raupapa whainga, he poto rawa ranei te tuatahi, ka ngawari te puta mai o nga hua pai. Me hoahoa ano nga kaupapa tuatahi. Whakawhitiwhitinga o nga raupapa whainga, hua whakakaha ranei: E rua nga take mo tenei poke: Tuatahi, ko te whakapataritari i te katoa o te ira ira, nga kongakonga nui ranei, ka puta he hua teka. Ka taea te whakatau i tenei pai teka ma nga tikanga e whai ake nei: Kia tupato me te ngawari i te wa e mahi ana kia kore ai e ngotea te raupapatanga ki roto i te tauira pu, ka pakaru mai ranei i te ngongo centrifuge. Hāunga ngā whākōkī me ngā matū e kore e tu ki te pāmahana teitei, me whakahoroa nga reagents me nga taputapu katoa ma te pehanga teitei. Kia kotahi te whakamahi i nga ngongo centrifuge me nga tohutohu paipa werohanga tauira. Mena e tika ana, ko nga ngongo tauhohenga me nga reagents ka whiti ki te rama ultraviolet i mua i te taapiri i te tauira hei whakangaro i nga waikawa karihi kei reira. Ko te tuarua ko te poke o nga kongakonga iti o te waikawa karihi i te rangi. He poto ake enei kongakonga iti i te raupapa whainga, engari he homology etahi. Ka taea te hono tetahi ki tetahi, a, i muri i te whakauru ki nga papa tuatahi, ka taea te whakanui ake i nga hua PCR, ka puta he hua teka, ka taea te whakaheke, te whakakore ranei i nga tikanga PCR kohanga.
3.Ka puta mai nga roopu whakakaha kore-motuhake Ko nga roopu ka puta i muri i te whakakaha PCR he rereke ki te rahi e tumanakohia ana, ahakoa he nui ake, he iti ake ranei, ka puta mai nga roopu whakahiato motuhake me nga roopu whakakaha kore-motuhake i te wa kotahi. Ko nga take o te ahua o nga roopu kore-motuhake ko: tuatahi, karekau i te tino whakakiia nga mea tuatahi ki te raupapa whainga, ka whakahiatohia ranei nga tuatahi ki te hanga dimer. Ko te take tuarua he tiketike rawa te kukū katote Mg2+, he iti rawa te pāmahana o te annealing, he tiketike rawa te maha o nga huringa PCR. Ko te take tuarua ko te kounga me te nui o te enzyme. Ko nga enzymes mai i etahi puna ka kaha ki nga roopu kore-motuhake engari ko nga enzymes mai i etahi atu puna kare. Ko te nui rawa o nga enzymes ka arahi ki te whakakaha kore-motuhake. Kei roto i nga mahi aukati: te hoahoa ano i nga kaupapa tuatahi mena e tika ana. Whakaitihia te nui o te enzyme, whakakapi ranei ki tetahi atu puna. Whakaitihia te nui o nga timatanga, whakanuia te nui o te tauira tika, me te whakaiti i te maha o nga huringa. Kia tika te whakanui ake i te paemahana annealing, whakamahia ranei te tikanga ira-rua-mahana ira (denaturation i te 93°C, te annealing me te toronga huri noa i te 65°C).
4. Ka puta te toia, te paninga ranei, ka puta te whakakaha PCR i etahi wa ka rite ki nga here pania, ki nga riipene rite-pepa, ki nga riipene pera i te whariki. Ko te nuinga o nga wa ka puta mai nga take na te nui rawa o te whākōkī, te iti rawa o te kounga o te whākōkī, te teitei o te kukū dNTP, te teitei o te Mg2+, te iti rawa o te pāmahana whakaene, me te maha o nga huringa. Kei roto i nga mahi aukati: ① Whakaitihia te nui o te whanariki, whakakapi ranei i te whana ki tetahi atu puna. ②Whakaitihia te kukū o te dNTP. Whakaititia tika te kukū Mg2+. Whakanuia te nui o nga tauira me te whakaiti i te maha o nga huringa
