FAQ amin'ny PCR 1. False négatif, tsy misy tady fanamafisam-peo mipoitra 2. False positive 3. Mipoitra ny tady fanamafisam-peo tsy voafaritra 4. Mipoitra ny tady misintona na smear:
1False negative, tsy misy tarika amplified miseho Ny lafiny fototra amin'ny fihetsiky ny PCR dia
① fanomanana ny template nucleic asidra
② kalitao voalohany sy manokana
③ kalitaon'ny enzyme sy
④ Toetran'ny tsingerin'ny PCR. Mba hahitana ny antony, dia tokony hatao ihany koa ny fanadihadiana sy fikarohana amin'ireo rohy etsy ambony.
Endrika:
① Ny môdely dia misy proteinina maloto
② Ny môdely dia misy Taq enzyme inhibitors
③ Ny proteinina ao amin'ny môdely dia tsy levonina sy esorina, indrindra fa ny histone ao amin'ny chromosomes
④ Be loatra ny very nandritra ny fitrandrahana sy ny fanomanana ny môdely, na ny phenol no nofoanana
⑤Ny asidra nucleic template dia tsy denaturation tanteraka. Rehefa tsara ny kalitaon'ny enzymes sy ny primers, raha tsy miseho ny tarika fanamafisam-peo, dia azo inoana fa misy zavatra tsy mety amin'ny dingan'ny fandevonan-kanina amin'ny santionany na ny dingan'ny fitrandrahana asidra nucleic template. Noho izany dia tsy maintsy amboarina ny vahaolana fandevonan-kanina mahomby sy marin-toerana, ary tsy maintsy amboarina ny fomba fiasa ary tsy tokony hovana amin'ny sitrapo. . Enzyme inactivation: Ilaina ny manolo ny anzima vaovao, na mampiasa anzima tranainy sy vaovao miaraka amin'ny fotoana iray mba hamakafakana raha vokatry ny fahaverezana na tsy ampy ny asan'ny enzyme ny ratsy diso. Tsara homarihina fa indraindray ny Taq enzyme dia hadino.Primers: Ny kalitao voalohany, ny fifantohana voalohany, ary na symmetrical ny fifantohana amin'ireo primers roa dia antony mahazatra ny tsy fahombiazan'ny PCR na ny tarika amplification tsy mahafa-po ary ny diffusion mora. Misy olana amin'ny kalitaon'ny synthesis primer amin'ny andiany sasany. Ny iray amin'ireo primers roa dia manana fifantohana ambony ary ny iray hafa dia manana fifantohana ambany, ka miteraka asymmetrika tsy dia mahomby.
Ny fanoherana dia:
① Mifidiana singa fototra synthesis tsara.
② Ny fifantohana amin'ny primers dia tsy tokony hijery fotsiny ny sandan'ny OD, fa koa ny fitandremana ny vahaolana stock primer ho an'ny electrophoresis gel agarose. Tsy maintsy misy tarika voalohany, ary tokony hitovy eo ho eo ny famirapiratry ny tarika roa. Ohatra, ny primer iray dia manana tarika ary ny iray hafa tsy misy tarika. Ho an'ny strips dia mety tsy mahomby ny PCR amin'izao fotoana izao ary tokony hovahana amin'ny fifampiraharahana amin'ny vondrona synthesis voalohany. Raha manana famirapiratana avo ny primer iray ary ambany famirapiratana ny iray hafa, ampifandanjao ny fifantohana rehefa manalefaka ny primer.
③ Ny primer dia tokony hotehirizina amin'ny fifantohana avo sy kely mba hisorohana ny fanala miverimberina sy ny fandoroana na ny fitehirizana maharitra ao amin'ny vata fampangatsiahana, izay mety hiteraka fahasimbana sy fahasimban'ny primer.
④Ny famolavolana primer dia tsy mitombina, toy ny tsy ampy ny halavan'ny primer, ny dimer dia miforona eo anelanelan'ny primers, sns. Mg2+ concentration: Mg2+ ion concentration dia misy fiantraikany lehibe amin'ny fahombiazan'ny amplification PCR. Raha avo loatra ny fifantohana dia mety hampihena ny fahasamihafan'ny fanamafisana ny PCR izany. Raha ambany loatra ny fifantohana dia hisy fiantraikany amin'ny vokatra fanamafisam-peo PCR izany ary hahatonga ny fanamafisam-peo PCR tsy hahomby raha tsy manamafy ny tarika. Fanovana ny habetsahan'ny fanehoan-kevitra: Matetika ny boky ampiasaina amin'ny PCR amplification dia 20ul, 30ul, ary 50ul. Na 100ul, inona ny habetsahana tokony hampiasaina amin'ny fanamafisana ny PCR dia napetraka araka ny tanjona samihafa amin'ny fikarohana siantifika sy ny fitsapana klinika. Rehefa avy manao boky kely, toy ny 20ul, ary avy eo manao boky lehibe kokoa, dia tsy maintsy manaraka ny fepetra, raha tsy izany dia ho mora foana. Antony ara-batana: Tena zava-dehibe ny denaturation amin'ny fanamafisana ny PCR. Raha toa ka ambany ny mari-pana denaturation ary fohy ny fotoana denaturation, dia mety hisy ny ratsy diso; ambany loatra ny mari-pana annealing, izay mety hiteraka fanamafisam-peo tsy voafaritra ary hampihena ny fahombiazan'ny fanamafisana manokana. Ny hafanan'ny annealing dia avo loatra. Tena misy fiantraikany amin'ny famatorana ny primer amin'ny maodely ary mampihena ny fahombiazan'ny amplification PCR. Indraindray dia ilaina ny mampiasa thermometer mahazatra mba hijerena ny mari-pana denaturation, annealing ary fanitarana ao amin'ny amplifier na vilany tsy misy rano. Izany ihany koa no iray amin'ireo antony mahatonga ny PCR tsy fahombiazana. Fiovaovan'ny filaharana kendrena: Raha miova na voafafa ny filaharana kendrena, izay misy fiantraikany amin'ny famatorana manokana ny primer amin'ny môdely, na ny primer sy ny môdely dia very ny filaharana mifameno noho ny famafana ny ampahany sasany amin'ny filaharana kendrena, ny fanamafisan'ny PCR tsy hahomby.
2.tsy tsara Ny tarika fanamafisam-peo PCR izay miseho dia mifanaraka amin'ny tarika filaharana kendrena, ary indraindray ny tarika dia milamina sy mamiratra kokoa. Famolavolana voalohany tsy mety: Ny filaharan'ny fanamafisam-peo voafantina dia manana homôlôjia miaraka amin'ny filaharana fanamafisam-peo tsy misy kendrena, ka rehefa manao fanamafisam-peo PCR, ny vokatra PCR ampitomboina dia filaharana tsy tanjona. Raha fohy loatra ny filaharana kendrena na fohy loatra ny primer, dia mety hitranga mora foana ny fanenjehana diso. Mila amboarina ny primer. Fandotoana mifanandrify amin'ny filaharan'ny kendrena na ny vokatra fanamafisam-peo: Misy antony roa mahatonga an'io fandotoana io: Voalohany, fandotoana ny fototarazo manontolo na sombin-javatra lehibe, mitarika ho amin'ny vokatra diso. Ity tsara diso ity dia azo vahana amin'ny alalan'ireto fomba manaraka ireto: Mitandrema sy malefaka rehefa miasa mba hisorohana ny fizotry ny kendrena tsy ho tsofina ao anatin'ny basy santionany na hiparitaka avy ao amin'ny fantsona centrifuge. Ankoatra ny anzima sy ny akora tsy mahatanty ny mari-pana ambony, ny reagents na fitaovana rehetra dia tokony ho sterilize amin'ny tsindry ambony. Ny fantsona centrifuge rehetra sy ny toro-hevitra pipette santionany dia tokony hampiasaina indray mandeha. Raha ilaina, dia taratra amin'ny taratra ultraviolet ny fantsona sy ny reagents alohan'ny hanampiana ny santionany handrava ny asidra nokleika misy. Ny faharoa dia ny fandotoana sombiny kely amin'ny asidra nokleika eny amin'ny rivotra. Ireo sombintsombiny kely ireo dia fohy kokoa noho ny filaharana kendrena, saingy manana homolojia sasany. Afaka mifamatotra izy ireo, ary aorian'ny famenoana ny primer, dia azo ampitomboina ny vokatra PCR, ka miteraka vokatra diso, izay azo ahena na esorina amin'ny fomba PCR nested.
3.Mipoitra ny tarika fanamafisam-peo tsy voafaritra Ny tarika izay miseho aorian'ny fanamafisan'ny PCR dia tsy mifanaraka amin'ny habeny andrasana, na lehibe na kely, na samy mipoitra miaraka ny tarika fanamafisam-peo manokana sy ny tarika fanamafisana tsy voafaritra. Ny antony mahatonga ny fisehon'ny tarika tsy voafaritra dia: voalohany, tsy mifameno tanteraka amin'ny filaharana kendrena ny primer, na mitambatra ho dimer ny primer. Ny antony faharoa dia ny fatran'ny ion Mg2+ dia avo loatra, ny mari-pana annealing dia ambany loatra, ary ny isan'ny tsingerin'ny PCR dia avo loatra. Ny antony faharoa dia ny kalitao sy ny habetsahan'ny enzyme. Ny enzyme avy amin'ny loharano sasany dia matetika mirona amin'ny tarika tsy voafaritra fa ny anzima avy amin'ny loharano hafa dia tsy. Ny habetsahan'ny anzima be loatra indraindray dia mety hitarika amin'ny fanamafisana tsy voafaritra. Ny fanoherana dia ahitana: fanavaozana ny primers raha ilaina. Ahena ny habetsahan'ny enzyme na soloy loharano hafa. Ahena ny isan'ny primer, ampitomboy araka ny tokony ho izy ny isan'ny môdely, ary ahena ny isan'ny tsingerina. Ampitomboy araka ny tokony ho izy ny mari-pana fanalefahana na ampiasao ny fomba toeran'ny mari-pana roa (dénaturation amin'ny 93°C, fanalana sy fanitarana manodidina ny 65°C).
4. Mipoitra ny fisintonana na smears, ny fanamafisam-peo PCR indraindray dia miseho toy ny bandy voasokajy, bandy toy ny lambam-baravarana na tady toy ny karipetra. Ny antony dia matetika vokatry ny enzyme be loatra na ny tsy fahampian'ny kalitaon'ny enzyme, ny dNTP avo loatra, ny Mg2+ avo loatra, ny mari-pana ambany loatra, ary ny tsingerina be loatra. Anisan'izany ny fanoherana: ① Ahena ny habetsahan'ny enzyme, na soloy loharano hafa ilay anzima. ②Ahena ny fifantohana amin'ny dNTP. Ahena araka ny tokony ho izy ny fifantohana Mg2+. Ampitomboy ny isan'ny môdely ary ahena ny isan'ny tsingerina
