PGR DUK 1. Klaidingai neigiamas, nėra amplifikacijos juostos 2. Klaidingai teigiama 3. Atsiranda nespecifinės amplifikacijos juostos 4. Atsiranda dribsnių vilkimo juostelės arba tepinėlio juostelės:

1 Klaidingai neigiamas, nėra sustiprintos juostos Pagrindiniai PGR reakcijos aspektai yra

① šabloninės nukleorūgšties paruošimas

② grunto kokybė ir specifiškumas

③ fermentų kokybė ir

④ PGR ciklo sąlygos. Norint išsiaiškinti priežastis, analizė ir tyrimai taip pat turėtų būti atliekami aukščiau pateiktose nuorodose.

Šablonas:

① Šablone yra priemaišų baltymų

② Šablone yra Taq fermento inhibitorių

③ Šablone esantys baltymai nėra virškinami ir nepašalinami, ypač histonai chromosomose

④ Ekstrahuojant ir ruošiant šabloną buvo prarasta per daug arba buvo įkvėpta fenolio

⑤ Šablono nukleorūgštis nėra visiškai denatūruota. Kai fermentų ir pradmenų kokybė gera, jei amplifikacijos juostų neatsiranda, greičiausiai kažkas negerai su mėginio virškinimo procesu arba šablono nukleorūgščių ekstrahavimo procesu. Todėl turi būti paruoštas efektyvus ir stabilus virškinimo tirpalas, o procedūra turi būti fiksuota ir nekeičiama savo nuožiūra. . Fermento inaktyvavimas: būtina pakeisti naują fermentą arba vienu metu naudoti senus ir naujus fermentus, kad būtų galima išanalizuoti, ar klaidingai neigiami rezultatai atsirado dėl fermento praradimo ar nepakankamo aktyvumo. Reikėtų pažymėti, kad kartais Taq fermentas pamirštamas. Pradmenys: pradmenų kokybė, pradmenų koncentracija ir tai, ar dviejų pradmenų koncentracijos yra simetriškos, yra dažnos PGR nesėkmės arba nepatenkinamos amplifikacijos juostos ir lengva difuzija priežastys. Kai kuriose partijose yra problemų dėl pradmenų sintezės kokybės. Vienas iš dviejų pradmenų turi didelę koncentraciją, o kitas turi mažą koncentraciją, todėl yra žemo efektyvumo asimetrinė amplifikacija.

Atsakomosios priemonės yra šios:

① Pasirinkite gerą pradmenų sintezės įrenginį.

② Nustatant pradmenų koncentraciją, reikia atsižvelgti ne tik į OD vertę, bet ir į pradinį pradinį tirpalą agarozės gelio elektroforezei. Turi būti grunto juostos, o dviejų grunto juostų ryškumas turi būti maždaug vienodas. Pavyzdžiui, vienas gruntas turi juostelę, o kitas – be juostos. Juostelėms PGR šiuo metu gali nepavykti ir turėtų būti išspręsta derantis su pradmenų sintezės įrenginiu. Jei vienas gruntas turi didelį ryškumą, o kitas – mažą, skiesdami gruntus subalansuokite koncentracijas.

③ Gruntai turi būti laikomi didelėmis koncentracijomis ir nedideliais kiekiais, kad būtų išvengta pakartotinio užšalimo ir atšildymo arba ilgalaikio laikymo šaldytuve, nes dėl to gruntai gali pablogėti ir suirti.

④Primerio konstrukcija yra neprotinga, pvz., nepakanka pradmenų ilgio, tarp pradmenų susidaro dimerai ir pan. Mg2+ koncentracija: Mg2+ jonų koncentracija turi didelę įtaką PGR amplifikacijos efektyvumui. Jei koncentracija yra per didelė, tai gali sumažinti PGR amplifikacijos specifiškumą. Jei koncentracija yra per maža, tai turės įtakos PGR amplifikacijos išeigai ir netgi sukels PGR amplifikacijos nesėkmę be stiprinimo juostų. Reakcijos tūrio pokyčiai: Paprastai PGR amplifikacijai naudojami tūriai yra 20 ul, 30 ul ir 50 ul. Arba 100 ul, koks tūris turi būti naudojamas PGR amplifikacijai, nustatomas pagal skirtingus mokslinių tyrimų ir klinikinių tyrimų tikslus. Padarius nedidelį tūrį, pvz., 20ul, o paskui darant didesnį tūrį, būtina laikytis sąlygų, antraip lengvai suges. Fizinės priežastys: denatūracija yra labai svarbi PGR amplifikacijai. Jei denatūravimo temperatūra žema, o denatūravimo laikas trumpas, labai tikėtina, kad atsiras klaidingai neigiami rezultatai; atkaitinimo temperatūra yra per žema, o tai gali sukelti nespecifinį stiprinimą ir sumažinti specifinį stiprinimo efektyvumą. Atkaitinimo temperatūra per aukšta. Labai veikia pradmenų prisijungimą prie šablonų ir sumažina PGR amplifikacijos efektyvumą. Kartais reikia naudoti standartinį termometrą, kad būtų patikrinta denatūravimo, atkaitinimo ir pratęsimo temperatūra stiprintuve arba vandenyje tirpiame puode. Tai taip pat yra viena iš PGR nesėkmės priežasčių. Tikslinės sekos variacija: jei tikslinė seka yra mutavusi arba pašalinta, o tai turi įtakos specifiniam pradmens prisijungimui prie šablono, arba pradmuo ir šablonas praranda komplementarią seką dėl tam tikro tikslinės sekos segmento ištrynimo, PGR amplifikacija. nepasiseks.

2. Klaidingai teigiama Pasirodanti PGR amplifikacijos juosta atitinka tikslinės sekos juostą, o kartais juosta yra tvarkingesnė ir ryškesnė. Netinkamas pradmenų dizainas: pasirinkta amplifikacijos seka yra homologija su netiksline amplifikacijos seka, todėl atliekant PGR amplifikaciją, amplifikuotas PGR produktas yra netikslinė seka. Jei tikslinė seka per trumpa arba pradmuo per trumpas, gali lengvai atsirasti klaidingų teigiamų rezultatų. Gruntus reikia pertvarkyti. Kryžminis tikslinių sekų arba amplifikacijos produktų užteršimas: yra dvi šio užteršimo priežastys: Pirma, kryžminis viso genomo arba didelių fragmentų užteršimas, dėl kurio gaunami klaidingi teigiami rezultatai. Šį klaidingą teigiamą rezultatą galima pašalinti šiais metodais: Dirbdami būkite atsargūs ir švelnūs, kad tikslinė seka neįsiurbtų į mėginio pistoletą arba neištaškytų iš centrifugos mėgintuvėlio. Išskyrus fermentus ir medžiagas, kurios negali atlaikyti aukštos temperatūros, visi reagentai ar įranga turi būti sterilizuojami aukštu slėgiu. Visi centrifugavimo mėgintuvėliai ir mėginių įpurškimo pipetės antgaliai turi būti naudojami vieną kartą. Jei reikia, reakcijos mėgintuvėliai ir reagentai apšvitinami ultravioletine šviesa prieš įdedant mėginį, kad būtų sunaikintos esančios nukleino rūgštys. Antrasis – nedidelių nukleorūgščių fragmentų užteršimas ore. Šie maži fragmentai yra trumpesni už tikslinę seką, tačiau turi tam tikrą homologiją. Jie gali būti sujungti vienas su kitu, o papildę pradmenis, PGR produktai gali būti amplifikuojami, todėl gaunami klaidingi teigiami rezultatai, kuriuos galima sumažinti arba pašalinti naudojant įdėtuosius PGR metodus.

 

3. Atsiranda nespecifinės amplifikacijos juostos Juostos, atsirandančios po PGR amplifikacijos, neatitinka numatomo dydžio, didesnės ar mažesnės, arba tuo pačiu metu atsiranda ir specifinės amplifikacijos juostos, ir nespecifinės amplifikacijos juostos. Nespecifinių juostų atsiradimo priežastys yra šios: pirma, pradmenys nevisiškai papildo tikslinę seką arba pradmenys agreguojasi ir sudaro dimerus. Antra priežastis – per didelė Mg2+ jonų koncentracija, per žema atkaitinimo temperatūra ir per didelis PGR ciklų skaičius. Antrasis veiksnys yra fermento kokybė ir kiekis. Kai kurių šaltinių fermentai dažnai yra linkę į nespecifines juostas, tačiau fermentai iš kitų šaltinių – ne. Per didelis fermentų kiekis kartais gali sukelti nespecifinį amplifikaciją. Priemonės apima: jei reikia, perprojektuokite gruntus. Sumažinkite fermento kiekį arba pakeiskite jį kitu šaltiniu. Sumažinkite pradmenų kiekį, atitinkamai padidinkite šablono kiekį ir sumažinkite ciklų skaičių. Tinkamai padidinkite atkaitinimo temperatūrą arba naudokite dviejų temperatūrų taškų metodą (denatūravimas 93 °C temperatūroje, atkaitinimas ir pratęsimas apie 65 °C).

 

4. Atsiranda dribsnių traukimas arba dėmės. PGR amplifikacija kartais atrodo kaip išteptos juostos, į lakštą panašios juostos arba į kilimą panašios juostos. Priežastys dažnai būna dėl per daug fermento arba prasta fermento kokybė, per didelė dNTP koncentracija, per didelė Mg2+ koncentracija, per žema atkaitinimo temperatūra ir per daug ciklų. Priemonės apima: ① Sumažinkite fermento kiekį arba pakeiskite fermentą kitu šaltiniu. ② Sumažinkite dNTP koncentraciją. Tinkamai sumažinkite Mg2+ koncentraciją. Padidinkite šablonų skaičių ir sumažinkite ciklų skaičių