PCR FAQ 1. False negative, no amplification band 2. False positive 3. Non-specific amplification bands appear 4. Flaky drag strips or smear strips appear ：
1False negative, ບໍ່ມີແຖບຂະຫຍາຍໃຫຍ່ຂື້ນ ລັກສະນະທີ່ສໍາຄັນຂອງປະຕິກິລິຍາ PCR ແມ່ນ
① ການກະກຽມຂອງອາຊິດ nucleic ແມ່ແບບ
②ຄຸນນະພາບ primer ແລະສະເພາະ
③ຄຸນນະພາບ enzyme ແລະ
④ ເງື່ອນໄຂວົງຈອນ PCR. ເພື່ອຊອກຫາເຫດຜົນ, ການວິເຄາະແລະການຄົ້ນຄວ້າຄວນດໍາເນີນການກ່ຽວກັບການເຊື່ອມຕໍ່ຂ້າງເທິງ.
ແມ່ແບບ:
① ແມ່ແບບປະກອບມີໂປຣຕີນທີ່ບໍ່ສະອາດ
② ແມ່ແບບປະກອບມີ Taq enzyme inhibitors
③ໂປຣຕີນໃນແມ່ແບບບໍ່ໄດ້ຖືກຍ່ອຍອາຫານ, ໂດຍສະເພາະແມ່ນ histones ໃນ chromosomes.
④ ການສູນເສຍຫຼາຍເກີນໄປໃນລະຫວ່າງການສະກັດເອົາແລະການກະກຽມຂອງແມ່ແບບ, ຫຼື phenol ໄດ້ຖືກຫາຍໃຈ
⑤ອາຊິດນິວຄລີອິກແມ່ແບບແມ່ນບໍ່ໄດ້ຖືກປັບໂດຍສົມບູນ. ໃນເວລາທີ່ຄຸນນະພາບຂອງ enzymes ແລະ primers ແມ່ນດີ, ຖ້າແຖບ amplification ບໍ່ປາກົດ, ມັນອາດຈະມີບາງສິ່ງບາງຢ່າງທີ່ຜິດພາດກັບຂະບວນການຍ່ອຍສະຫຼາຍຂອງຕົວຢ່າງຫຼືຂະບວນການສະກັດເອົາອາຊິດ nucleic ຂອງແມ່ແບບ. ດັ່ງນັ້ນ, ການແກ້ໄຂການຍ່ອຍອາຫານທີ່ມີປະສິດທິພາບແລະຫມັ້ນຄົງຕ້ອງໄດ້ຮັບການກະກຽມ, ແລະຂັ້ນຕອນຄວນໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂແລະບໍ່ຄວນປ່ຽນແປງຕາມຄວາມຕັ້ງໃຈ. . Enzyme inactivation: ມັນເປັນສິ່ງຈໍາເປັນເພື່ອທົດແທນ enzymes ໃຫມ່, ຫຼືນໍາໃຊ້ທັງສອງ enzymes ເກົ່າແລະໃຫມ່ໃນເວລາດຽວກັນເພື່ອວິເຄາະວ່າ negatives ທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງແມ່ນເກີດມາຈາກການສູນເສຍຫຼືກິດຈະກໍາຂອງ enzyme ບໍ່ພຽງພໍ. ມັນຄວນຈະສັງເກດວ່າບາງຄັ້ງ enzyme Taq ໄດ້ຖືກລືມ.Primers: ຄຸນະພາບຂອງ primer, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ primer, ແລະບໍ່ວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ primers ສອງແມ່ນສົມມາດເປັນເຫດຜົນທົ່ວໄປສໍາລັບຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ PCR ຫຼືແຖບການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ຫນ້າພໍໃຈແລະການແຜ່ກະຈາຍງ່າຍ. ມີບັນຫາກ່ຽວກັບຄຸນນະພາບຂອງການສັງເຄາະ primer ໃນບາງຊຸດ. ຫນຶ່ງໃນສອງ primers ມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງແລະອີກອັນຫນຶ່ງມີຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຕ່ໍາ, ເຮັດໃຫ້ການຂະຫຍາຍ asymmetric ປະສິດທິພາບຕ່ໍາ.
ມາດຕະການຕອບໂຕ້ຄື:
① ເລືອກຫນ່ວຍງານສັງເຄາະ primer ທີ່ດີ.
② ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ primers ບໍ່ພຽງແຕ່ເບິ່ງມູນຄ່າ OD, ແຕ່ຍັງເອົາໃຈໃສ່ກັບການແກ້ໄຂຫຼັກຊັບ primer ສໍາລັບ agarose gel electrophoresis. ຕ້ອງມີແຖບ primer, ແລະຄວາມສະຫວ່າງຂອງສອງແຖບ primer ຄວນປະມານຄືກັນ. ຕົວຢ່າງ, primer ຫນຶ່ງມີແຖບແລະ primer ອື່ນໆບໍ່ມີແຖບ. ສໍາລັບເສັ້ນດ່າງ, PCR ອາດຈະລົ້ມເຫລວໃນເວລານີ້ແລະຄວນໄດ້ຮັບການແກ້ໄຂໂດຍຜ່ານການເຈລະຈາກັບຫນ່ວຍງານສັງເຄາະ primer. ຖ້າ primer ຫນຶ່ງມີຄວາມສະຫວ່າງສູງແລະອີກອັນຫນຶ່ງມີຄວາມສະຫວ່າງຕ່ໍາ, ດຸ່ນດ່ຽງຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນໃນເວລາທີ່ເຈືອຈາງ primers.
③ primers ຄວນຖືກເກັບໄວ້ໃນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງແລະປະລິມານຫນ້ອຍເພື່ອປ້ອງກັນການແຊ່ແຂງແລະ thawing ຊ້ໍາຊ້ອນຫຼືເກັບຮັກສາໄວ້ໃນຕູ້ເຢັນໃນໄລຍະຍາວ, ເຊິ່ງອາດຈະເຮັດໃຫ້ primers ເຊື່ອມໂຊມແລະເຊື່ອມໂຊມ.
④ ການອອກແບບ primer ແມ່ນບໍ່ສົມເຫດສົມຜົນ, ເຊັ່ນ: ຄວາມຍາວ primer ແມ່ນບໍ່ພຽງພໍ, dimers ສ້າງຕັ້ງຂຶ້ນລະຫວ່າງ primers, ແລະອື່ນໆ. ຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ Mg2+: ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ Mg2+ ion ມີອິດທິພົນຢ່າງຫຼວງຫຼາຍຕໍ່ປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR. ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນສູງເກີນໄປ, ມັນສາມາດຫຼຸດຜ່ອນຄວາມສະເພາະຂອງການຂະຫຍາຍ PCR. ຖ້າຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຕໍ່າເກີນໄປ, ມັນຈະສົ່ງຜົນກະທົບຕໍ່ຜົນຜະລິດຂະຫຍາຍ PCR ແລະແມ້ກະທັ້ງເຮັດໃຫ້ການຂະຫຍາຍ PCR ລົ້ມເຫລວໂດຍບໍ່ມີການຂະຫຍາຍແຖບ. ການປ່ຽນແປງຂອງປະລິມານປະຕິກິລິຍາ: ປົກກະຕິແລ້ວປະລິມານທີ່ໃຊ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນ 20ul, 30ul, ແລະ 50ul. ຫຼື 100ul, ປະລິມານທີ່ຄວນຈະຖືກນໍາໃຊ້ສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນຖືກກໍານົດໄວ້ຕາມຈຸດປະສົງທີ່ແຕກຕ່າງກັນຂອງການຄົ້ນຄວ້າວິທະຍາສາດແລະການທົດສອບທາງດ້ານການຊ່ວຍ. ຫຼັງຈາກເຮັດໃຫ້ປະລິມານຂະຫນາດນ້ອຍ, ເຊັ່ນ 20ul, ແລະຫຼັງຈາກນັ້ນເຮັດໃຫ້ປະລິມານຂະຫນາດໃຫຍ່, ທ່ານຕ້ອງປະຕິບັດຕາມເງື່ອນໄຂ, ຖ້າບໍ່ດັ່ງນັ້ນມັນຈະລົ້ມເຫລວໄດ້ງ່າຍ. ເຫດຜົນທາງກາຍະພາບ: denaturation ມີຄວາມສໍາຄັນຫຼາຍສໍາລັບການຂະຫຍາຍ PCR. ຖ້າອຸນຫະພູມ denaturation ແມ່ນຕໍ່າແລະເວລາ denaturation ແມ່ນສັ້ນ, ຜົນກະທົບທີ່ບໍ່ດີແມ່ນເປັນໄປໄດ້ຫຼາຍ; ອຸນຫະພູມ annealing ແມ່ນຕ່ໍາເກີນໄປ, ຊຶ່ງສາມາດເຮັດໃຫ້ເກີດການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະແລະຫຼຸດຜ່ອນປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍສະເພາະ. ອຸນຫະພູມການຫມູນວຽນແມ່ນສູງເກີນໄປ. ມີຜົນກະທົບສູງຕໍ່ການຜູກມັດຂອງ primers ກັບແມ່ແບບແລະຫຼຸດຜ່ອນປະສິດທິພາບການຂະຫຍາຍ PCR. ບາງຄັ້ງມັນຈໍາເປັນຕ້ອງໃຊ້ເຄື່ອງວັດແທກອຸນຫະພູມມາດຕະຖານເພື່ອກວດກາເບິ່ງຄວາມຫນາແຫນ້ນ, ການຫມູນວຽນແລະການຂະຫຍາຍອຸນຫະພູມໃນເຄື່ອງຂະຫຍາຍສຽງຫຼືຫມໍ້ນ້ໍາທີ່ລະລາຍ. ນີ້ແມ່ນຫນຶ່ງໃນເຫດຜົນສໍາລັບຄວາມລົ້ມເຫຼວຂອງ PCR. ການປ່ຽນແປງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ: ຖ້າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍຖືກປ່ຽນແປງຫຼືຖືກລົບ, ເຊິ່ງມີຜົນກະທົບຕໍ່ການຜູກມັດສະເພາະຂອງ primer ກັບແມ່ແບບ, ຫຼື primer ແລະ template ສູນເສຍລໍາດັບທີ່ສົມບູນເນື່ອງຈາກການລຶບສ່ວນທີ່ແນ່ນອນຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ການຂະຫຍາຍ PCR. ຈະບໍ່ປະສົບຜົນສໍາເລັດ.
2.false positive ແຖບຂະຫຍາຍ PCR ທີ່ປາກົດແມ່ນສອດຄ່ອງກັບແຖບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ແລະບາງຄັ້ງແຖບແມ່ນເປັນລະບຽບແລະສົດໃສກວ່າ. ການອອກແບບ primer ທີ່ບໍ່ເຫມາະສົມ: ລໍາດັບ amplification ທີ່ເລືອກມີ homology ກັບລໍາດັບ amplification ທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າຫມາຍ, ດັ່ງນັ້ນໃນເວລາທີ່ປະຕິບັດການຂະຫຍາຍ PCR, ຜະລິດຕະພັນ PCR amplified ແມ່ນລໍາດັບທີ່ບໍ່ແມ່ນເປົ້າຫມາຍ. ຖ້າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍສັ້ນເກີນໄປຫຼື primer ສັ້ນເກີນໄປ, ບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງອາດຈະເກີດຂື້ນໄດ້ງ່າຍ. Primers ຕ້ອງໄດ້ຮັບການອອກແບບໃຫມ່. ການປົນເປື້ອນຂ້າມຂອງລໍາດັບເປົ້າຫມາຍຫຼືຜະລິດຕະພັນຂະຫຍາຍ: ມີສອງເຫດຜົນສໍາລັບການປົນເປື້ອນນີ້: ທໍາອິດ, ການປົນເປື້ອນຂ້າມຂອງ genome ທັງຫມົດຫຼືຊິ້ນຂະຫນາດໃຫຍ່, ນໍາໄປສູ່ການບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ. ບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງນີ້ສາມາດແກ້ໄຂໄດ້ໂດຍວິທີການດັ່ງຕໍ່ໄປນີ້: ຈົ່ງລະມັດລະວັງແລະອ່ອນໂຍນໃນເວລາປະຕິບັດງານເພື່ອປ້ອງກັນບໍ່ໃຫ້ລໍາດັບເປົ້າຫມາຍຖືກດູດເຂົ້າໄປໃນປືນຕົວຢ່າງຫຼືກະແຈກກະຈາຍອອກຈາກທໍ່ centrifuge. ຍົກເວັ້ນ enzymes ແລະສານທີ່ບໍ່ສາມາດທົນກັບອຸນຫະພູມສູງ, reagents ຫຼືອຸປະກອນທັງຫມົດຄວນໄດ້ຮັບການຂ້າເຊື້ອໂດຍຄວາມກົດດັນສູງ. ທໍ່ centrifuge ທັງຫມົດແລະຄໍາແນະນໍາທໍ່ສີດຕົວຢ່າງຄວນຖືກນໍາໃຊ້ຄັ້ງດຽວ. ຖ້າຈໍາເປັນ, ທໍ່ຕິກິຣິຍາແລະ reagents ໄດ້ຖືກ irradiated ກັບແສງ ultraviolet ກ່ອນທີ່ຈະເພີ່ມຕົວຢ່າງທີ່ຈະທໍາລາຍອາຊິດ nucleic ປະຈຸບັນ. ອັນທີສອງແມ່ນການປົນເປື້ອນຂອງຊິ້ນນ້ອຍໆຂອງອາຊິດນິວເຄຼຍໃນອາກາດ. ຊິ້ນສ່ວນນ້ອຍໆເຫຼົ່ານີ້ສັ້ນກວ່າລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ແຕ່ມີຄວາມຄ້າຍຄືກັນທີ່ແນ່ນອນ. ພວກເຂົາສາມາດຖືກແຍກອອກຈາກກັນແລະກັນ, ແລະຫຼັງຈາກຖືກເສີມກັບ primers, ຜະລິດຕະພັນ PCR ສາມາດຂະຫຍາຍໄດ້, ເຊິ່ງກໍ່ໃຫ້ເກີດຜົນບວກທີ່ບໍ່ຖືກຕ້ອງ, ເຊິ່ງສາມາດຫຼຸດລົງຫຼືລົບລ້າງໂດຍວິທີການ PCR ທີ່ຖືກຮັງ.
3. ແຖບຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະປາກົດ ແຖບທີ່ປາກົດຫຼັງຈາກການຂະຫຍາຍ PCR ແມ່ນບໍ່ສອດຄ່ອງກັບຂະຫນາດທີ່ຄາດໄວ້, ບໍ່ວ່າຈະຂະຫນາດໃຫຍ່ຫຼືນ້ອຍກວ່າ, ຫຼືທັງສອງແຖບ amplification ສະເພາະແລະແຖບຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະຈະປາກົດໃນເວລາດຽວກັນ. ເຫດຜົນສໍາລັບການປະກົດຕົວຂອງແຖບທີ່ບໍ່ແມ່ນສະເພາະແມ່ນ: ທໍາອິດ, primers ແມ່ນບໍ່ຄົບຖ້ວນສົມບູນກັບລໍາດັບເປົ້າຫມາຍ, ຫຼື primers ລວບລວມເພື່ອສ້າງ dimers. ເຫດຜົນທີສອງແມ່ນວ່າຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ ion Mg2+ ແມ່ນສູງເກີນໄປ, ອຸນຫະພູມການຫມູນວຽນແມ່ນຕໍ່າເກີນໄປ, ແລະຈໍານວນຂອງວົງຈອນ PCR ແມ່ນສູງເກີນໄປ. ປັດໄຈທີສອງແມ່ນຄຸນນະພາບແລະປະລິມານຂອງເອນໄຊ. Enzymes ຈາກບາງແຫຼ່ງແມ່ນມັກຈະເປັນແຖບທີ່ບໍ່ແມ່ນສະເພາະແຕ່ enzymes ຈາກແຫຼ່ງອື່ນໆບໍ່ໄດ້. ປະລິມານຫຼາຍເກີນໄປຂອງ enzymes ບາງຄັ້ງສາມາດນໍາໄປສູ່ການຂະຫຍາຍທີ່ບໍ່ສະເພາະ. ມາດຕະການຕອບໂຕ້ປະກອບມີ: ການປັບປຸງ primers ຖ້າຫາກວ່າຈໍາເປັນ. ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງ enzyme ຫຼືທົດແທນມັນດ້ວຍແຫຼ່ງອື່ນ. ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານ primers, ເພີ່ມປະລິມານຂອງແມ່ແບບທີ່ເຫມາະສົມ, ແລະຫຼຸດຜ່ອນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນ. ເພີ່ມອຸນຫະພູມການເນລະມິດໃຫ້ເໝາະສົມ ຫຼືໃຊ້ວິທີຈຸດສອງອຸນຫະພູມ (ການເສື່ອມຕົວຢູ່ທີ່ 93°C, ການໜຽວ ແລະຂະຫຍາຍປະມານ 65°C).
4.Flaky drag ຫຼື smears ປະກົດ PCR amplification ບາງຄັ້ງປະກົດເປັນແຖບ smeared, ແຖບຄ້າຍຄືແຜ່ນຫຼືແຖບຄ້າຍຄືຜ້າພົມ. ສາເຫດແມ່ນມັກຈະເກີດຈາກ enzyme ຫຼາຍເກີນໄປຫຼືຄຸນນະພາບຂອງ enzyme ບໍ່ດີ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນ dNTP ສູງເກີນໄປ, ຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ Mg2+ ສູງເກີນໄປ, ອຸນຫະພູມຕ່ໍາເກີນໄປ, ແລະຮອບວຽນຫຼາຍເກີນໄປ. ມາດຕະການຕ້ານປະກອບມີ: ① ຫຼຸດຜ່ອນປະລິມານຂອງ enzyme, ຫຼືທົດແທນ enzyme ກັບແຫຼ່ງອື່ນ. ②ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂຸ້ນຂອງ dNTP. ຫຼຸດຜ່ອນຄວາມເຂັ້ມຂົ້ນຂອງ Mg2+ ຢ່າງເໝາະສົມ. ເພີ່ມປະລິມານຂອງແມ່ແບບແລະຫຼຸດຜ່ອນຈໍານວນຂອງຮອບວຽນ
