PCR FAQ 1. Falsch negativ, keng Amplifikatiounsband erschéngt 2. Falsch positiv 3. Net spezifesch Amplifikatiounsbands erschéngen 4. Flaky Dragsträifen oder Schmierstreifen erschéngen:
1 Falsch negativ, keng verstäerkte Band erschéngt Déi Schlëssel Aspekter vun der PCR Reaktioun sinn
① Virbereedung vun Template Nukleinsäure
② Primer Qualitéit a Spezifizitéit
③ Enzym Qualitéit an
④ PCR Zyklus Konditiounen. Fir d'Grënn ze fannen, Analyse a Fuerschung sollten och op den uewe genannte Linken duerchgefouert ginn.
Schabloun:
① D'Schabloun enthält Gëftproteine
② D'Schabloun enthält Taq Enzyminhibitoren
③ D'Proteine an der Schabloun ginn net verdaut an ewechgeholl, besonnesch d'Histone a Chromosomen
④ Ze vill gouf während der Extraktioun an der Preparatioun vun der Schabloun verluer, oder Phenol gouf inhaléiert
⑤D'Schabloun Nukleinsäure ass net komplett denaturéiert. Wann d'Qualitéit vun Enzymen a Primer gutt ass, wann Amplifikatiounsbands net erscheinen, ass et héchstwahrscheinlech datt et eppes falsch ass mam Verdauungsprozess vum Exemplar oder dem Schabloun Nukleinsäure Extraktiounsprozess. Dofir muss eng effektiv a stabil Verdauungsléisung virbereet ginn, an d'Prozedur soll fixéiert ginn an net op Wëllen geännert ginn. . Enzyminaktivéierung: Et ass néideg den neien Enzym ze ersetzen, oder souwuel al wéi och nei Enzyme zur selwechter Zäit ze benotzen fir ze analyséieren ob falsch Negativer duerch Verloscht oder net genuch Enzymaktivitéit verursaacht ginn. Et sollt bemierkt datt heiansdo d'Taq Enzym vergiess gëtt.Primers: Primer Qualitéit, Primer Konzentratioun, an ob d'Konzentratioune vun den zwee Primer symmetresch sinn, sinn allgemeng Ursaachen fir PCR Echec oder onzefriddenen Amplifikatiounsbänner an einfach Diffusioun. Et gi Problemer mat der Qualitéit vun der Primer Synthese an e puer Chargen. Ee vun den zwee Primer huet eng héich Konzentratioun an deen aneren huet eng niddreg Konzentratioun, wat zu enger gerénger Effizienz asymmetrescher Amplifikatioun resultéiert.
D'Géigemoossname sinn:
① Wielt eng gutt Primer Synthese Eenheet.
② D'Konzentratioun vu Primer sollt net nëmmen den OD Wäert kucken, awer och oppassen op d'Primer-Stockléisung fir Agarosegel Elektrophorese. Et musse Primerbänner sinn, an d'Hellegkeet vun den zwee Primerbänner soll ongeféier d'selwecht sinn. Zum Beispill, een Primer huet eng Band an deen aneren Primer huet keng Band. Fir Sträifen, kann PCR zu dëser Zäit versoen a soll duerch Verhandlunge mat der Primer Synthese Eenheet geléist ginn. Wann ee Primer héich Hellegkeet huet an deen aneren niddereg Hellegkeet huet, balanséiert d'Konzentratioune beim Verdünnung vun de Primer.
③ Primer sollen an héijer Konzentratioun a klenge Quantitéite gespäichert ginn fir widderholl Gefrierzen an Ofdehnung oder laangfristeg Lagerung am Frigo ze vermeiden, wat zu enger Verschlechterung an der Degradatioun vun de Primer féieren kann.
④De Primer Design ass onverständlech, sou wéi d'Primerlängt net genuch ass, Dimere ginn tëscht Primer geformt, etc. Mg2+ Konzentratioun: Mg2+ Ion Konzentratioun huet e groussen Afloss op PCR Amplifikatiounseffizienz. Wann d'Konzentratioun ze héich ass, kann et d'Spezifizitéit vun der PCR Amplifikatioun reduzéieren. Wann d'Konzentratioun ze niddreg ass, beaflosst et d'PCR Verstäerkung Ausbezuelen a souguer d'PCR Verstäerkung versoen ouni Verstäerkung Bands. Ännerungen am Reaktiounsvolumen: Normalerweis sinn d'Bänn, déi fir PCR Amplifikatioun benotzt ginn, 20ul, 30ul, a 50ul. Oder 100ul, wéi ee Volumen soll fir PCR Verstäerkung benotzt ginn, gëtt no verschiddenen Zwecker vun der wëssenschaftlecher Fuerschung a klinescher Tester festgeluecht. Nodeems Dir e klenge Volumen gemaach hutt, wéi 20ul, an dann e méi grousst Volumen ze maachen, musst Dir d'Konditioune befollegen, soss wäert et liicht falen. Kierperlech Grënn: Denaturatioun ass ganz wichteg fir PCR Amplifikatioun. Wann d'Denaturatiounstemperatur niddereg ass an d'Denaturatiounszäit kuerz ass, si falsch Negativer ganz wahrscheinlech optrieden; d'Annealtemperatur ass ze niddreg, wat net spezifesch Verstäerkung verursaache kann an déi spezifesch Verstäerkungseffizienz reduzéieren. D'Glühungstemperatur ass ze héich. Héich Afloss op d'Bindung vu Primer zu Templates a reduzéiert d'PCR Amplifikatiounseffizienz. Heiansdo ass et néideg e Standard-Thermometer ze benotzen fir d'Denaturatiouns-, annealing- an Extensiounstemperaturen am Verstärker oder Waasserlösleche Pot ze kontrolléieren. Dëst ass och ee vun de Grënn fir PCR Echec. Zilsequenzvariatioun: Wann d'Zielsequenz mutéiert oder geläscht gëtt, wat d'spezifesch Bindung vum Primer un d'Schabloun beaflosst, oder de Primer an d'Schabloun verléieren déi komplementär Sequenz wéinst der Läschung vun engem bestëmmte Segment vun der Zilsequenz, d'PCR Amplifikatioun wäert net erfollegräich ginn.
2.falsch positiv D'PCR Amplifikatiounsband déi erschéngt ass konsequent mat der Zilsequenzband, an heiansdo ass d'Band méi uerdentlech a méi hell. Onpassend Primer Design: Déi gewielte Verstäerkungssequenz huet Homologie mat der net-Zilverstärkungssequenz, also wann Dir PCR Verstäerkung ausféiert, ass dat amplifizéiert PCR Produkt eng net-Ziel Sequenz. Wann d'Zielsequenz ze kuerz ass oder de Primer ze kuerz ass, kënne falsch Positiver einfach optrieden. Primer mussen nei designt ginn. Kräizkontaminatioun vun Zilsequenzen oder Amplifikatiounsprodukter: Et ginn zwee Grënn fir dës Kontaminatioun: Éischtens, Kräizkontaminatioun vum ganze Genom oder grousse Fragmenter, wat zu falsche Positiven féiert. Dëse falsche Positiv kann mat de folgende Methoden geléist ginn: Sidd virsiichteg a sanft wann Dir operéiert fir ze verhënneren datt d'Zielsequenz an d'Probe-Pistoul gesaugt gëtt oder aus dem Zentrifuge-Röhre gesprëtzt gëtt. Ausser Enzymen a Substanzen déi net héich Temperaturen ausstoen, sollten all Reagenz oder Ausrüstung duerch Héichdrock steriliséiert ginn. All Zentrifuge Réier a Probe Injektiounspipette Tipps sollten eemol benotzt ginn. Wann néideg, ginn d'Reaktiounsröhren an d'Reagenser mat ultraviolettem Liicht bestrahlt, ier Dir d'Exemplar bäidréit fir d'Nukleinsäuren ze zerstéieren. Déi zweet ass d'Kontaminatioun vu klenge Fragmenter vun Nukleinsäuren an der Loft. Dës kleng Fragmenter si méi kuerz wéi d'Zielsequenz, awer hu gewësse Homologie. Si kënne matenee gespléckt ginn, an nodeems se komplementär zu de Primer sinn, kënnen d'PCR-Produkter verstäerkt ginn, wat zu falsche Positiver resultéiert, déi duerch nestet PCR Methoden reduzéiert oder eliminéiert kënne ginn.
3.Non-spezifesch Amplifikatiounsbands erschéngen D'Bands, déi no der PCR-Verstäerkung erscheinen, sinn inkonsequent mat der erwaarter Gréisst, entweder méi grouss oder méi kleng, oder béid spezifesch Amplifikatiounsbands an net-spezifesch Amplifikatiounsbands erschéngen zur selwechter Zäit. D'Grënn fir d'Erscheinung vun net spezifesche Bands sinn: éischtens sinn d'Primeren net komplett komplementär zu der Zilsequenz, oder d'Primeren aggregéiere fir Dimeren ze bilden. Den zweete Grond ass datt d'Mg2+ Ionkonzentratioun ze héich ass, d'Annealtemperatur ze niddreg ass an d'Zuel vun de PCR Zyklen ze héich ass. Den zweete Faktor ass d'Qualitéit an d'Quantitéit vum Enzym. Enzyme aus e puer Quelle sinn dacks ufälleg fir net-spezifesch Bands, awer Enzyme aus anere Quellen net. Exzessiv Quantitéiten un Enzyme kënnen heiansdo zu net spezifescher Amplifikatioun féieren. D'Géigemoossnamen enthalen: Redesign Primer wann néideg. Reduzéiert d'Quantitéit vum Enzym oder ersetzt se mat enger anerer Quell. Reduzéieren d'Quantitéit vun de Primer, erhéijen d'Quantitéit vun der Schabloun entspriechend, a reduzéiert d'Zuel vun den Zyklen. Erhéije d'Glühungstemperatur entspriechend oder benotzt d'Zwee-Temperaturpunkt-Methode (Denaturatioun bei 93 ° C, Glühung an Ausdehnung ëm 65 ° C).
4.Flaky Drag oder Schmieren erschéngen PCR Verstäerkung heiansdo erschéngt als geschmiert Bands, Blat-wëll Bands oder Teppech-wëll Bands. D'Grënn sinn dacks verursaacht duerch ze vill Enzym oder schlecht Qualitéit vum Enzym, ze héich dNTP Konzentratioun, ze héich Mg2+ Konzentratioun, ze niddreg Glühtemperatur an ze vill Zyklen. D'Géigemoossnamen enthalen: ① D'Quantitéit vum Enzym reduzéieren oder den Enzym mat enger anerer Quell ersetzen. ②D'Konzentratioun vun dNTP reduzéieren. Gëeegent reduzéieren d'Mg2+ Konzentratioun. Erhéije d'Quantitéit u Templates a reduzéiert d'Zuel vun den Zyklen
