PCR FAQ 1. Жалган терс, күчөтүү тилкеси көрүнбөйт 2. Жалган оң 3. Белгилүү эмес күчөтүү тилкелери пайда болот 4. Жалбыртма сүйрөө тилкелери же мазут тилкелери пайда болот:

1Жалган терс, күчөтүлгөн тилке пайда болбойт ПТР реакциясынын негизги аспектилери болуп саналат

① шаблон нуклеин кислотасын даярдоо

② праймердин сапаты жана өзгөчөлүгү

③ фермент сапаты жана

④ ПТР циклинин шарттары. Себебин табуу үчүн жогорудагы шилтемелер боюнча анализ жана изилдөөлөр да жүргүзүлүшү керек.

Үлгү:

① Шаблон ыплас протеиндерди камтыйт

② Шаблон Taq энзим ингибиторлорун камтыйт

③ Калыптагы белоктор сиңирилбейт жана алынып салынбайт, айрыкча хромосомалардагы гистондор.

④ Үлгү алууда жана даярдоодо өтө көп жоголгон же фенол дем алган

⑤ Калып нуклеин кислотасы толугу менен денатурацияланган эмес. Ферменттердин жана праймерлердин сапаты жакшы болгондо, күчөтүү тилкелери көрүнбөсө, анда үлгүнүн сиңирүү процессинде же калыптын нуклеин кислотасын алуу процессинде бир нерсе туура эмес болушу мүмкүн. Ошондуктан, натыйжалуу жана туруктуу сиңирүү эритмеси даярдалышы керек, ал эми процедураны бекитип, каалагандай өзгөртпөө керек. . Ферментти инактивациялоо: Жаңы ферментти алмаштыруу керек, же бир эле учурда эски жана жаңы ферменттерди колдонуп, жалган негативдер ферменттин жоголушу же жетишсиз активдүүлүгүнөн улам келип чыкканын талдоо керек. Белгилей кетчү нерсе, кээде Taq ферменти унутулуп калат.Праймерлер: Праймердин сапаты, праймердин концентрациясы жана эки праймердин концентрациялары симметриялуубу - бул ПЦРдин иштебей калышынын же канааттандырарлык эмес күчөтүү тилкелеринин жана жеңил диффузиянын жалпы себептери. Кээ бир партияларда праймерлердин синтезинин сапаты боюнча көйгөйлөр бар. Эки праймердин бири жогорку концентрацияга ээ, экинчиси аз концентрацияга ээ, натыйжада эффективдүүлүгү төмөн асимметриялык күчөтүү.

каршы чаралар болуп төмөнкүлөр саналат:

① Жакшы праймер синтези бирдигин тандаңыз.

② Праймерлердин концентрациясы OD маанисин гана карабастан, ошондой эле агароз гелинин электрофорези үчүн праймердин запастык эритмесине көңүл бурушу керек. Праймер тилкелери болушу керек жана эки праймер тилкесинин жарыктыгы болжол менен бирдей болушу керек. Мисалы, бир праймерде тилке бар, экинчи праймерде тилке жок. тилкелер үчүн, ПТР учурда ишке ашпай калышы мүмкүн жана праймер синтези бирдиги менен сүйлөшүү жолу менен чечилиши керек. Эгерде бир праймердин жарыктыгы жогору болсо, экинчисинин жарыктыгы төмөн болсо, праймерлерди суюлтууда концентрацияларды теңдеңиз.

③ Примерлерди кайра-кайра тоңдуруу жана эрүү же муздаткычта узак мөөнөткө сактоо үчүн жогорку концентрацияда жана аз өлчөмдө сактоо керек, бул праймерлердин начарлашына жана бузулушуна алып келиши мүмкүн.

④Праймердин дизайны негизсиз, мисалы, праймердин узундугу жетишсиз, праймерлердин ортосунда димерлер пайда болот, ж.б. Mg2+ концентрациясы: Mg2+ ионунун концентрациясы ПТР күчөтүү эффективдүүлүгүнө чоң таасирин тийгизет. Эгерде концентрация өтө жогору болсо, ал ПЦР күчөтүүнүн өзгөчөлүгүн төмөндөтүшү мүмкүн. Эгерде концентрация өтө төмөн болсо, ал ПТР күчөтүү түшүмүнө таасирин тийгизет жана ал тургай, тилкелерди күчөтпөстөн ПТР күчөтүү иштебей калышына алып келет. Реакция көлөмүнүн өзгөрүшү: Адатта ПЦР күчөтүү үчүн колдонулган көлөмдөр 20ul, 30ul жана 50ul болуп саналат. Же 100ul, ПТР күчөтүү үчүн колдонулушу керек болгон көлөмү илимий изилдөө жана клиникалык тестирлөөнүн ар кандай максаттарына ылайык белгиленет. Кичинекей көлөмдү, мисалы, 20ул кылып, анан чоңураак көлөмдү жасагандан кийин, шарттарды аткарыш керек, антпесе оңой эле иштебей калат. Физикалык себептер: ПЦР күчөтүү үчүн денатурация абдан маанилүү. Эгерде денатурация температурасы төмөн жана денатурация убактысы кыска болсо, анда жалган негативдер пайда болушу ыктымал; күйгүзүү температурасы өтө төмөн, бул спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн жана өзгөчө күчөтүү натыйжалуулугун төмөндөтөт. Жылуулоо температурасы өтө жогору. Праймерлердин шаблондорго туташуусуна чоң таасирин тийгизет жана ПТР күчөтүү натыйжалуулугун төмөндөтөт. Кээде күчөткүчтөгү же сууда эрүүчү идиштеги денатурация, күйгүзүү жана узартуу температурасын текшерүү үчүн стандарттуу термометрди колдонуу керек болот. Бул да ПЦР жетишсиздигинин себептеринин бири. Максаттуу ырааттуулуктун вариациясы: Эгерде максаттуу ырааттуулук мутацияга учураса же жок кылынса, бул праймердин шаблон менен спецификалык байланышына таасирин тийгизет, же праймер менен шаблон максаттуу ырааттуулуктун белгилүү бир сегментинин жок кылынышынан улам толуктоочу ырааттуулугун жоготсо, ПТР күчөтүү ийгиликтүү болбойт.

2.false оң Пайда болгон ПТР күчөтүү тилкеси максаттуу ырааттуу тилке менен шайкеш келет, ал эми кээде тилке тартиптүү жана жаркыраган. Туура эмес праймердин дизайны: Тандалган күчөтүү ырааттуулугу максаттуу эмес күчөтүү ырааттуулугу менен гомологияга ээ, ошондуктан ПТР күчөтүүнү жүзөгө ашырууда күчөтүлгөн ПТР продуктусу максаттуу эмес ырааттуулук болуп саналат. Эгерде максаттуу ырааттуулук өтө кыска же праймер өтө кыска болсо, жалган позитивдер оңой пайда болушу мүмкүн. Праймерлерди кайра иштеп чыгуу керек. Максаттуу тизмектердин же күчөтүү продуктуларынын кайчылаш булганышы: Бул булгануунун эки себеби бар: Биринчиден, бүт геномдун же чоң фрагменттердин кайчылаш булганышы, жалган позитивдерге алып келет. Бул жалган позитивди төмөнкү ыкмалар менен чечсе болот: Иштеп жатканда этият жана жумшак болуңуз, максаттуу ырааттуулук үлгү тапанчасына сорулуп же центрифуга түтүкчөсүнөн чачырабашы үчүн. Жогорку температурага туруштук бере албаган ферменттерден жана заттардан башка бардык реагенттер же жабдуулар жогорку басым менен стерилдештирилиши керек. Бардык центрифуга түтүктөрүн жана үлгү инъекциялык пипеткалардын учтарын бир жолу колдонуу керек. Зарыл болгон учурда реакция түтүктөрү жана реагенттер үлгүнү кошуунун алдында нуклеиндик кислоталарды жок кылуу үчүн ультрафиолет нуру менен нурлантылат. Экинчиси – абадагы нуклеин кислоталарынын майда фрагменттеринин булганышы. Бул кичинекей фрагменттер максаттуу ырааттуулуктан кыскараак, бирок белгилүү бир гомологияга ээ. Аларды бири-бирине кошууга болот, жана праймерлерге кошумча болгондон кийин, ПТР продуктулары күчөтүлүшү мүмкүн, натыйжада жалган позитивдер пайда болот, аларды уяча ПТР ыкмалары менен азайтууга же жок кылууга болот.

 

3.Спецификалык эмес күчөтүү тилкелери пайда болот. ПТР күчөтүлгөндөн кийин пайда болгон тилкелер күтүлгөн өлчөмдөргө туура келбейт, же чоңураак же кичине, же эки өзгөчө күчөтүү тилкелери менен спецификалык эмес күчөтүү тилкелери бир убакта пайда болот. Белгилүү эмес тилкелердин пайда болушунун себептери: биринчиден, праймерлер максаттуу ырааттуулукту толук толуктабайт, же праймерлер биригип, димерлерди түзүшөт. Экинчи себеп Mg2+ ионунун концентрациясы өтө жогору, күйгүзүү температурасы өтө төмөн жана ПТР циклдарынын саны өтө жогору. Экинчи фактор - бул ферменттин сапаты жана саны. Кээ бир булактардан алынган ферменттер көбүнчө спецификалык эмес тилкелерге жакын болушат, бирок башка булактардан алынган ферменттер андай эмес. Ашыкча өлчөмдөгү ферменттер кээде спецификалык эмес күчөтүүгө алып келиши мүмкүн. Каршы чаралар төмөнкүлөрдү камтыйт: зарыл болсо, праймерлерди кайра конструкциялоо. Ферменттин көлөмүн азайтыңыз же аны башка булак менен алмаштырыңыз. Праймерлердин санын азайтыңыз, шаблондун көлөмүн тийиштүү түрдө көбөйтүңүз жана циклдердин санын азайтыңыз. Күйүү температурасын тийиштүү түрдө жогорулатыңыз же эки температуралык чекиттик ыкманы колдонуңуз (93°C денатурация, 65°C тегерегинде күйдүрүү жана узартуу).

 

4.Капыртма сүйрөө же сүртүүлөр пайда болот ПТР күчөтүү кээде сыйрылган тилкелер, барак сымал тилкелер же килем сымал тилкелер түрүндө пайда болот. Себептери көбүнчө ферменттин өтө көп же сапатсыз сапаты, өтө жогору dNTP концентрациясы, өтө жогору Mg2+ концентрациясы, өтө төмөн күйгүзүү температурасы жана өтө көп циклдер менен шартталган. Каршы чараларга төмөнкүлөр кирет: ① Ферменттин көлөмүн азайтыңыз же ферментти башка булак менен алмаштырыңыз. ②dNTP концентрациясын азайтыңыз. Mg2+ концентрациясын тийиштүү түрдө азайтыңыз. Шаблондордун санын көбөйтүңүз жана циклдердин санын азайтыңыз