PCR Pirs û Bersîv 1. Negatîfiya derewîn, bandê zêdekirinê dernakeve.
1 Negatîfiya derewîn, bendek zêdekirî xuya nake Aliyên sereke yên reaksiyona PCR ev in
① amadekirina şablonê asîda nukleîk
② kalîte û taybetmendiya primer
③ kalîteya enzîmê û
④ şert û mercên çerxa PCR. Ji bo dîtina sedeman, analîz û lêkolîn jî li ser lînkên jorîn bêne kirin.
Şablon:
① Şablon proteînên nepaqijiyê dihewîne
② Şablon înhîbîtorên enzîma Taq dihewîne
③ Proteînên di şablonê de nayên helandin û jêbirin, nemaze histonên di kromozoman de
④ Di dema derxistin û amadekirina şablonê de pir zêde winda bû, an jî fenol hat hilanîn
⑤Asîda nukleîk a şablonê bi tevahî nayê denaturîzekirin. Gava ku qalîteya enzîm û primeran baş be, ger bandên amplîfasyonê xuya nebin, bi îhtîmalek mezin di pêvajoya xwarkirina nimûneyê de an jî di pêvajoya derxistina asîda nukleîk a şablonê de tiştek xelet heye. Ji ber vê yekê, pêdivî ye ku çareseriyek bikêr û bi îstîqrar were amadekirin, û prosedur were sererast kirin û bi kêfa xwe neyê guheztin. . Bêçalakkirina enzîmê: Pêdivî ye ku enzîma nû biguhezîne, an jî enzîmên kevin û nû di heman demê de bikar bîne da ku analîz bike ka neyînîyên derewîn ji windabûn an kêmbûna çalakiya enzîmê têne çêkirin. Divê were zanîn ku carinan enzîma Taq tê jibîrkirin.Prîmer: Qalîteya destpêk, kombûna primerê û hevsengiya her du prîmeran sedemên hevpar in ji bo têkçûna PCR an jî bandên zêdekirina ne têrker û belavkirina hêsan. Di hin beşan de bi kalîteya senteza primer re pirsgirêk hene. Yek ji du destpêkeran xwedan konsantreyek bilind û ya din xwedan konsantreyek nizm e, ku di encamê de zêdekirina asîmetrîk kêm-bandor dibe.
Tedbîrên dijber ev in:
① Yekîneyek senteza destpêkek baş hilbijêrin.
② Pêdivî ye ku giraniya primera ne tenê li nirxa OD-ê binêre, lê di heman demê de balê bikişîne ser çareseriya stoka pêşîn a ji bo elektroforeziya gel agarose. Pêdivî ye ku bendên aşîkar hebin, û ronahiya her du bandên aşîkar hema hema yek be. Mînak, aşîtek bend heye û aşîkara din bend nîne. Ji bo strips, PCR dibe ku di vê demê de têk biçe û divê bi danûstandinê bi yekîneya senteza primer re were çareser kirin. Ger arîmerek xwedan ronahiya bilind û ya din xwedan ronahiya kêm be, dema ku arîmeran dirijînin hevsengiyê bidin hev.
③ Pêdivî ye ku primers di konsantasyona bilind û mîqdarên piçûk de werin hilanîn da ku pêşî li cemidandin û şilbûna dubare an hilgirtina demdirêj a di sarincokê de bigire, ku dibe sedema xerabûn û xirabûna primers.
④Sêwirana primerê ne maqûl e, wek ku dirêjahiya primerê ne bes e, dimer di navbera primeraran de çêdibin, hwd. Kêmbûna Mg2+: Giraniya îyona Mg2+ bandorek mezin li ser karîgeriya zêdekirina PCR dike. Ger konsantre pir zêde be, ew dikare taybetmendiya zêdekirina PCR kêm bike. Ger konsantasyon pir kêm be, ew ê bandorê li hilberîna zêdekirina PCR bike û tewra dibe sedem ku zêdekirina PCR bêyî zêdekirina bandan têk biçe. Guhertinên di hêjmara reaksiyonê de: Bi gelemperî cildên ku ji bo zêdekirina PCR têne bikar anîn 20ul, 30ul, û 50ul in. An jî 100 ul, çi cildê divê ji bo zêdekirina PCR were bikar anîn li gorî mebestên cihêreng ên lêkolîna zanistî û ceribandina klînîkî tête danîn. Piştî çêkirina cildek piçûk, wek 20ul, û dûv re çêkirina cildeyek mezintir, divê hûn şertan bişopînin, wekî din ew ê bi hêsanî têk bibe. Sedemên laşî: Denaturasyon ji bo zêdekirina PCR pir girîng e. Ger germahiya denaturasyonê kêm be û dema denaturasyonê kurt be, dibe ku neyînîyên derewîn çêbibin; germahiya lêdanê pir nizm e, ku dikare bibe sedema zêdekirina ne-taybetî û kargêriya zêdekirina taybetî kêm bike. Germahiya helandinê pir zêde ye. Pir bandorê li girêdana primeran bi şablonan dike û karbidestiya zêdekirina PCR kêm dike. Carinan hewce ye ku termometreyek standard were bikar anîn da ku germahiya denaturasyon, helandin û dirêjkirina di amplifikator an potek ku di avê de çareser dibe were kontrol kirin. Ev jî yek ji sedemên têkçûna PCR ye. Guhertoya rêza armancê: Heke rêzika armanc were mutasyon an jêbirin, ku bandorê li girêdana taybetî ya primer bi şablonê re dike, an jî destpêk û şablon ji ber jêbirina beşek diyarkirî ya rêza armancê rêzika temamker winda bikin, zêdekirina PCR. dê ne serkeftî be.
2. pozîtîf xelet Bandora zêdekirina PCR ya ku xuya dibe bi band rêza armancê re hevaheng e, û carinan band bi rêkûpêktir û geştir e. Sêwirana pêşîn a neguncayî: Rêza zêdekirina hilbijartî bi rêzika zêdekirina ne-armanc re homologî ye, ji ber vê yekê dema ku zêdekirina PCR-ê tê kirin, hilbera PCR-ya zêdekirî rêzek ne-armanc e. Ger rêzika armanc pir kurt be an jî arîkar pir kurt be, dibe ku erênîyên derewîn bi hêsanî çêbibin. Pêdivî ye ku serokwezîr ji nû ve bêne sêwirandin. Xaça-tevlîhevkirina rêzikên armanc an hilberên zêdekirinê: Du sedemên vê gemariyê hene: Yekem, tevlihevbûna tevheviya genomê an perçeyên mezin, ku dibe sedema erênîyên derewîn. Ev pozîtîfiya derewîn bi rêbazên jêrîn dikare were çareser kirin: Dema ku kar dikin baldar û nerm bin ku rê nedin rêzika armancê di nav çeka nimûneyê de neyê mêşkirin an ji lûleya santrîfujê dernekeve. Ji bilî enzîm û maddeyên ku nikarin li ber germahiya bilind bisekinin, divê hemî reagent an amûr bi zexta bilind bêne sterilîzekirin. Pêdivî ye ku hemî lûleyên santrîfujê û tîpên pîpeta derzîlêdana nimûneyê carekê werin bikar anîn. Ger hewce be, lûle û reagentên reaksiyonê bi ronahiya ultraviyole têne tîrêj kirin berî ku nimûneyê lê zêde bikin da ku asîdên nukleî yên heyî hilweşînin. Ya duyemîn qirêjbûna perçeyên piçûk ên asîdên nukleî yên li hewayê ye. Van perçeyên piçûk ji rêzika armancê kurttir in, lê hin homologî hene. Ew dikarin bi hevûdu re bêne qut kirin, û piştî ku bi primers re temam bikin, hilberên PCR dikarin werin zêdekirin, û di encamê de erênîyên derewîn çêbibin, ku dikarin bi rêbazên PCR-yê nested kêm bibin an jêbirin.
3. Bendên xurtkirinê yên ne-taybet xuya dikin Bendên ku piştî zêdekirina PCR-ê xuya dibin bi mezinahiya çaverêkirî re naguncînin, an mezintir an piçûktir, an hem bandên xurtkirinê yên taybetî û hem jî bandên zêdekirina netaybet di heman demê de xuya dibin. Sedemên xuyabûna bendên ne-taybet ev in: yekem, primers bi tevahî rêza armancê temam nakin, an jî primers berhev dibin da ku dimeran çêbikin. Sedema duyemîn ev e ku konsantasyona ion Mg2+ pir zêde ye, germahiya annealkirinê pir kêm e, û hejmara çerxên PCR pir zêde ye. Faktora duyemîn kalîte û mîqdara enzîmê ye. Enzîmên ji hin çavkaniyan bi gelemperî berbi bendên ne-taybetî ne lê enzîmên ji çavkaniyên din ne. Rêjeya zêde ya enzîman carinan dikare bibe sedema zêdekirina ne-taybetî. Di nav tedbîran de ev in: Ger hewce be ji nû ve sêwirana primers. Mîqdara enzîmê kêm bikin an jî çavkaniyek din biguhezînin. Mîqdara primers kêm bikin, mîqdara şablonê bi rêkûpêk zêde bikin, û hejmara dewreyan kêm bikin. Germahiya lêdanê bi rêkûpêk zêde bikin an jî rêbaza xala du-germiyê bikar bînin (denaturasyon di 93°C de, lêdan û dirêjkirina li dora 65°C).
4. Kêşkêşî an şûşeyên felq xuya dibin Hêzkirina PCR carinan wekî bandên qermiçî, bandên mîna pelan an bandên mîna xalîçeyê xuya dike. Sedem bi gelemperî ji ber enzîmek pir zêde an jî kalîteya qels a enzîmê, giraniya pir zêde ya dNTP, giraniya pir zêde ya Mg2+, germahiya pir nizm a pîvazkirinê, û pir çerx têne çêkirin. Tedbîrên dijber ev in: ① Mîqdara enzîmê kêm bikin, an enzîm bi çavkaniyek din biguhezînin. ②Kêmbûna dNTP kêm bikin. Bi guncav hûrbûna Mg2+ kêm bikin. Hejmara şablonan zêde bikin û hejmara dewreyan kêm bikin
