PCR FAQ 1. 위음성, 증폭 밴드가 나타나지 않음 2. 위양성 3. 비특이적 증폭 밴드가 나타남 4. 색다른 드래그 스트립 또는 스미어 스트립이 나타남:

1위음성, 증폭된 밴드가 나타나지 않음 PCR 반응의 주요 측면은 다음과 같습니다.

① 주형핵산 준비

② 프라이머 품질 및 특이성

③ 효소의 품질과

④ PCR 사이클 조건. 그 이유를 찾으려면 위의 링크에서 분석과 연구도 수행되어야 합니다.

주형:

① 템플릿에는 불순물 단백질이 포함되어 있습니다.

② 템플릿에는 Taq 효소 억제제가 포함되어 있습니다.

③ 주형에 있는 단백질, 특히 염색체에 있는 히스톤이 소화되어 제거되지 않습니다.

④ 템플릿 추출 및 준비 과정에서 너무 많은 양이 손실되었거나, 페놀이 흡입된 경우

⑤주형핵산은 완전히 변성되지 않았습니다. 효소와 프라이머의 품질이 좋을 때 증폭 밴드가 나타나지 않으면 검체의 분해 과정이나 주형 핵산 추출 과정에 문제가 있을 가능성이 높습니다. 그러므로 효과적이고 안정적인 소화액을 준비해야 하며, 과정은 고정되어야 하고 임의로 변경되어서는 안 된다. . 효소 불활성화: 새로운 효소를 교체하거나, 기존 효소와 새로운 효소를 동시에 사용하여 위음성이 효소 활성 손실 또는 불충분으로 인해 발생하는지 분석해야 합니다. Taq 효소를 잊어버리는 경우도 있다는 점에 유의해야 합니다. 프라이머: 프라이머 품질, 프라이머 농도 및 두 프라이머의 농도가 대칭인지 여부는 PCR 실패 또는 불만족스러운 증폭 밴드 및 쉬운 확산의 일반적인 원인입니다. 일부 배치에서는 프라이머 합성 품질에 문제가 있습니다. 두 프라이머 중 하나는 농도가 높고 다른 하나는 농도가 낮아 비대칭 증폭 효율이 낮습니다.

대책은 다음과 같습니다.

① 좋은 프라이머 합성 유닛을 선택한다.

② 프라이머의 농도는 OD 값뿐만 아니라 아가로스겔 전기영동을 위한 프라이머 원액에도 주의해야 합니다. 프라이머 밴드가 있어야 하며, 두 프라이머 밴드의 밝기가 대략 동일해야 합니다. 예를 들어, 한 프라이머에는 밴드가 있고 다른 프라이머에는 밴드가 없습니다. Strip의 경우 이때 PCR이 실패할 수 있으므로 Primer 합성부와 협의를 통해 해결해야 합니다. 한 프라이머의 밝기가 높고 다른 프라이머의 밝기가 낮은 경우 프라이머를 희석할 때 농도의 균형을 맞추세요.

③ 프라이머는 동결과 해동이 반복되거나 냉장고에 장기간 보관할 경우 프라이머의 변질 및 변질이 발생할 수 있으므로 고농도, 소량으로 보관해야 합니다.

④프라이머 길이가 충분하지 않거나, 프라이머 사이에 이합체가 생기는 등 프라이머 디자인이 불합리합니다. Mg2+ 농도: Mg2+ 이온 농도는 PCR 증폭 효율에 큰 영향을 미칩니다. 농도가 너무 높으면 PCR 증폭의 특이성이 떨어질 수 있습니다. 농도가 너무 낮으면 PCR 증폭 수율에 영향을 미치고 증폭 밴드 없이 PCR 증폭이 실패하는 원인이 될 수도 있습니다. 반응 부피의 변화: 일반적으로 PCR 증폭에 사용되는 부피는 20ul, 30ul, 50ul입니다. 또는 100ul, PCR 증폭에 어느 정도의 용량을 사용해야 하는지는 과학 연구 및 임상 시험의 다양한 목적에 따라 설정됩니다. 20ul 등의 작은 볼륨을 만든 후, 큰 볼륨을 만든 후 조건을 따라야 합니다. 그렇지 않으면 쉽게 실패합니다. 물리적 이유: 변성은 PCR 증폭에 매우 중요합니다. 변성 온도가 낮고 변성 시간이 짧으면 위음성이 발생할 가능성이 매우 높습니다. 어닐링 온도가 너무 낮으면 비특이적 증폭이 발생하고 특정 증폭 효율이 감소할 수 있습니다. 어닐링 온도가 너무 높습니다. 프라이머와 템플릿의 결합에 큰 영향을 미치고 PCR 증폭 효율을 감소시킵니다. 때로는 증폭기 또는 수용성 포트의 변성, 어닐링 및 확장 온도를 확인하기 위해 표준 온도계를 사용해야 합니다. 이는 PCR 실패의 원인 중 하나이기도 합니다. 표적 서열 변이: 표적 서열이 변이되거나 결실되어 프라이머와 주형의 특이적 결합에 영향을 주거나, 표적 서열의 특정 세그먼트가 결실되어 프라이머와 주형이 상보적인 서열을 상실한 경우, PCR 증폭 성공하지 못할 것입니다.

2.false positive 나타나는 PCR 증폭 밴드는 표적 서열 밴드와 일치하며 때로는 밴드가 더 질서 있고 밝습니다. 부적절한 프라이머 디자인: 선택된 증폭 서열이 비표적 증폭 서열과 상동성을 가지므로 PCR 증폭을 수행할 때 증폭된 PCR 산물이 비표적 서열입니다. 타겟 서열이 너무 짧거나 프라이머가 너무 짧으면 위양성이 쉽게 발생할 수 있습니다. 프라이머를 다시 디자인해야 합니다. 표적 서열 또는 증폭 산물의 교차 오염: 이 오염에는 두 가지 이유가 있습니다. 첫째, 전체 게놈 또는 큰 단편의 교차 오염으로 인해 위양성이 발생합니다. 이 잘못된 긍정은 다음 방법으로 해결할 수 있습니다. 대상 시퀀스가 ​​샘플 건으로 빨려 들어가거나 원심 분리기 튜브 밖으로 튀는 것을 방지하기 위해 작동할 때 주의하고 부드럽게 주의하십시오. 고온에 견디지 못하는 효소나 물질을 제외한 모든 시약이나 장비는 고압으로 멸균해야 한다. 모든 원심분리 튜브와 시료 주입 피펫 팁은 한 번만 사용해야 합니다. 필요한 경우, 존재하는 핵산을 파괴하기 위해 검체를 추가하기 전에 반응 튜브와 시약에 자외선을 조사합니다. 두 번째는 공기 중의 작은 핵산 조각의 오염입니다. 이러한 작은 조각은 표적 서열보다 짧지만 특정한 상동성을 가지고 있습니다. 이들은 서로 스플라이싱될 수 있으며, 프라이머에 상보적인 PCR 산물이 증폭되어 위양성이 발생할 수 있으며 이는 중첩된 PCR 방법으로 줄이거나 제거될 수 있습니다.

 

3.비특이적 증폭 밴드가 나타난다 PCR 증폭 후 나타나는 밴드는 크거나 작거나 기대했던 크기와 일치하지 않거나, 특이적 증폭 밴드와 비특이적 증폭 밴드가 동시에 나타납니다. 비특이적 밴드가 나타나는 이유는 첫째, 프라이머가 표적 서열에 완전히 상보적이지 않거나 프라이머가 응집하여 이합체를 형성하기 때문입니다. 두 번째 이유는 Mg2+ 이온 농도가 너무 높고, 어닐링 온도가 너무 낮으며, PCR 사이클 수가 너무 높기 때문입니다. 두 번째 요소는 효소의 품질과 양입니다. 일부 소스의 효소는 종종 비특이적 밴드가 발생하는 경향이 있지만 다른 소스의 효소는 그렇지 않습니다. 과도한 양의 효소는 때때로 비특이적 증폭으로 이어질 수 있습니다. 대책에는 다음이 포함됩니다. 필요한 경우 프라이머를 재설계합니다. 효소의 양을 줄이거나 다른 소스로 교체하십시오. 프라이머 양을 줄이고, 템플릿 양을 적절하게 늘리고, 주기 수를 줄이세요. 어닐링 온도를 적절하게 높이거나 2온도점법(93°C에서 변성, 65°C 부근에서 어닐링 및 신장)을 사용하십시오.

 

4. 벗겨지는 끌림이나 번짐이 나타남 PCR 증폭은 때로 번진 띠, 시트 모양의 띠 또는 카펫 같은 띠로 나타납니다. 그 이유는 종종 효소가 너무 많거나 효소 품질이 좋지 않은 경우, dNTP 농도가 너무 높은 경우, Mg2+ 농도가 너무 높은 경우, 어닐링 온도가 너무 낮은 경우, 사이클이 너무 많은 경우 등이 있습니다. 대책은 다음과 같습니다. ① 효소의 양을 줄이거나 효소를 다른 공급원으로 교체합니다. ②dNTP의 농도를 줄입니다. Mg2+ 농도를 적절하게 줄입니다. 템플릿 양을 늘리고 주기 수를 줄입니다.