PCR FAQ 1. ತಪ್ಪು ಋಣಾತ್ಮಕ, ಯಾವುದೇ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಕಾಣಿಸುವುದಿಲ್ಲ 2. ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕ 3. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಗೋಚರಿಸುತ್ತವೆ 4. ಫ್ಲಾಕಿ ಡ್ರ್ಯಾಗ್ ಸ್ಟ್ರಿಪ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಸ್ಮೀಯರ್ ಸ್ಟ್ರಿಪ್‌ಗಳು ಗೋಚರಿಸುತ್ತವೆ:
1 ತಪ್ಪು ಋಣಾತ್ಮಕ, ಯಾವುದೇ ವರ್ಧಿತ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಗೋಚರಿಸುವುದಿಲ್ಲ PCR ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆಯ ಪ್ರಮುಖ ಅಂಶಗಳು
① ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ತಯಾರಿಕೆ
② ಪ್ರೈಮರ್ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆ
③ ಕಿಣ್ವದ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು
④ PCR ಸೈಕಲ್ ಪರಿಸ್ಥಿತಿಗಳು. ಕಾರಣಗಳನ್ನು ಕಂಡುಹಿಡಿಯಲು, ಮೇಲಿನ ಲಿಂಕ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ವಿಶ್ಲೇಷಣೆ ಮತ್ತು ಸಂಶೋಧನೆಯನ್ನು ಸಹ ನಡೆಸಬೇಕು.
ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್:
① ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಅಶುದ್ಧ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ
② ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ Taq ಕಿಣ್ವ ಪ್ರತಿರೋಧಕಗಳನ್ನು ಒಳಗೊಂಡಿದೆ
③ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನಲ್ಲಿರುವ ಪ್ರೋಟೀನ್‌ಗಳು ಜೀರ್ಣವಾಗುವುದಿಲ್ಲ ಮತ್ತು ತೆಗೆದುಹಾಕುವುದಿಲ್ಲ, ವಿಶೇಷವಾಗಿ ಕ್ರೋಮೋಸೋಮ್‌ಗಳಲ್ಲಿನ ಹಿಸ್ಟೋನ್‌ಗಳು
④ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಹೊರತೆಗೆಯುವಿಕೆ ಮತ್ತು ತಯಾರಿಕೆಯ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ತುಂಬಾ ಕಳೆದುಹೋಗಿದೆ ಅಥವಾ ಫೀನಾಲ್ ಅನ್ನು ಉಸಿರಾಡಲಾಗುತ್ತದೆ
⑤ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲವನ್ನು ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಡಿನೇಚರ್ ಮಾಡಲಾಗಿಲ್ಲ. ಕಿಣ್ವಗಳು ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಗುಣಮಟ್ಟವು ಉತ್ತಮವಾದಾಗ, ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಷನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಕಾಣಿಸದಿದ್ದರೆ, ಮಾದರಿಯ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಅಥವಾ ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲದ ಹೊರತೆಗೆಯುವ ಪ್ರಕ್ರಿಯೆಯಲ್ಲಿ ಏನಾದರೂ ತಪ್ಪಾಗಿದೆ. ಆದ್ದರಿಂದ, ಪರಿಣಾಮಕಾರಿ ಮತ್ತು ಸ್ಥಿರವಾದ ಜೀರ್ಣಕ್ರಿಯೆಯ ಪರಿಹಾರವನ್ನು ಸಿದ್ಧಪಡಿಸಬೇಕು, ಮತ್ತು ಕಾರ್ಯವಿಧಾನವನ್ನು ಸರಿಪಡಿಸಬೇಕು ಮತ್ತು ಇಚ್ಛೆಯಂತೆ ಬದಲಾಯಿಸಬಾರದು. . ಕಿಣ್ವ ನಿಷ್ಕ್ರಿಯಗೊಳಿಸುವಿಕೆ: ಹೊಸ ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಬದಲಿಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ, ಅಥವಾ ಅದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಹಳೆಯ ಮತ್ತು ಹೊಸ ಕಿಣ್ವಗಳೆರಡನ್ನೂ ಬಳಸಿ ತಪ್ಪು ನಿರಾಕರಣೆಗಳು ನಷ್ಟ ಅಥವಾ ಸಾಕಷ್ಟು ಕಿಣ್ವದ ಚಟುವಟಿಕೆಯಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆಯೇ ಎಂಬುದನ್ನು ವಿಶ್ಲೇಷಿಸಲು. ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ Taq ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಮರೆತುಬಿಡಲಾಗುತ್ತದೆ ಎಂದು ಗಮನಿಸಬೇಕು. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು: ಪ್ರೈಮರ್ ಗುಣಮಟ್ಟ, ಪ್ರೈಮರ್ ಸಾಂದ್ರತೆ, ಮತ್ತು ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಗಳು ಸಮ್ಮಿತೀಯವಾಗಿದೆಯೇ ಎಂಬುದು PCR ವೈಫಲ್ಯ ಅಥವಾ ಅತೃಪ್ತಿಕರ ವರ್ಧನೆ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಸುಲಭ ಪ್ರಸರಣಕ್ಕೆ ಸಾಮಾನ್ಯ ಕಾರಣಗಳಾಗಿವೆ. ಕೆಲವು ಬ್ಯಾಚ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್‌ನ ಗುಣಮಟ್ಟದಲ್ಲಿ ಸಮಸ್ಯೆಗಳಿವೆ. ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಲ್ಲಿ ಒಂದು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಕಡಿಮೆ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಇದು ಕಡಿಮೆ-ದಕ್ಷತೆಯ ಅಸಮಪಾರ್ಶ್ವದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ.
ಪ್ರತಿಕ್ರಮಗಳು ಹೀಗಿವೆ:
① ಉತ್ತಮ ಪ್ರೈಮರ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಘಟಕವನ್ನು ಆಯ್ಕೆಮಾಡಿ.
② ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಸಾಂದ್ರತೆಯು OD ಮೌಲ್ಯವನ್ನು ಮಾತ್ರ ನೋಡಬಾರದು, ಆದರೆ ಅಗರೋಸ್ ಜೆಲ್ ಎಲೆಕ್ಟ್ರೋಫೋರೆಸಿಸ್‌ಗಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಸ್ಟಾಕ್ ಪರಿಹಾರಕ್ಕೆ ಗಮನ ಕೊಡಬೇಕು. ಪ್ರೈಮರ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಇರಬೇಕು ಮತ್ತು ಎರಡು ಪ್ರೈಮರ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳ ಹೊಳಪು ಸರಿಸುಮಾರು ಒಂದೇ ಆಗಿರಬೇಕು. ಉದಾಹರಣೆಗೆ, ಒಂದು ಪ್ರೈಮರ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಪ್ರೈಮರ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಅನ್ನು ಹೊಂದಿಲ್ಲ. ಸ್ಟ್ರಿಪ್‌ಗಳಿಗಾಗಿ, ಪಿಸಿಆರ್ ಈ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ವಿಫಲವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್ ಸಿಂಥೆಸಿಸ್ ಯೂನಿಟ್‌ನೊಂದಿಗೆ ಮಾತುಕತೆಯ ಮೂಲಕ ಪರಿಹರಿಸಬೇಕು. ಒಂದು ಪ್ರೈಮರ್ ಹೆಚ್ಚಿನ ಹೊಳಪನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ಇನ್ನೊಂದು ಕಡಿಮೆ ಹೊಳಪನ್ನು ಹೊಂದಿದ್ದರೆ, ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ದುರ್ಬಲಗೊಳಿಸುವಾಗ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸಮತೋಲನಗೊಳಿಸಿ.
③ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ರೆಫ್ರಿಜರೇಟರ್‌ನಲ್ಲಿ ಪುನರಾವರ್ತಿತ ಘನೀಕರಿಸುವಿಕೆ ಮತ್ತು ಕರಗುವಿಕೆ ಅಥವಾ ದೀರ್ಘಕಾಲೀನ ಶೇಖರಣೆಯನ್ನು ತಡೆಗಟ್ಟಲು ಹೆಚ್ಚಿನ ಸಾಂದ್ರತೆ ಮತ್ತು ಸಣ್ಣ ಪ್ರಮಾಣದಲ್ಲಿ ಸಂಗ್ರಹಿಸಬೇಕು, ಇದು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಅವನತಿ ಮತ್ತು ಅವನತಿಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು.
④ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸವು ಅಸಮಂಜಸವಾಗಿದೆ, ಉದಾಹರಣೆಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ ಉದ್ದವು ಸಾಕಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ನಡುವೆ ಡೈಮರ್‌ಗಳು ರಚನೆಯಾಗುತ್ತವೆ, ಇತ್ಯಾದಿ. Mg2+ ಸಾಂದ್ರತೆ: Mg2+ ಅಯಾನು ಸಾಂದ್ರತೆಯು PCR ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯ ಮೇಲೆ ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಭಾವ ಬೀರುತ್ತದೆ. ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿದ್ದರೆ, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ನಿರ್ದಿಷ್ಟತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು. ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ, ಇದು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ಇಳುವರಿ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸದೆ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯು ವಿಫಲಗೊಳ್ಳಲು ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಪರಿಮಾಣದಲ್ಲಿನ ಬದಲಾವಣೆಗಳು: ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ PCR ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಬಳಸುವ ಪರಿಮಾಣಗಳು 20ul, 30ul ಮತ್ತು 50ul. ಅಥವಾ 100ul, ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗಾಗಿ ಯಾವ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಬಳಸಬೇಕು ಎಂಬುದನ್ನು ವೈಜ್ಞಾನಿಕ ಸಂಶೋಧನೆ ಮತ್ತು ಕ್ಲಿನಿಕಲ್ ಪರೀಕ್ಷೆಯ ವಿವಿಧ ಉದ್ದೇಶಗಳ ಪ್ರಕಾರ ಹೊಂದಿಸಲಾಗಿದೆ. 20ul ನಂತಹ ಸಣ್ಣ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಮಾಡಿದ ನಂತರ ಮತ್ತು ನಂತರ ದೊಡ್ಡ ಪರಿಮಾಣವನ್ನು ಮಾಡಿದ ನಂತರ, ನೀವು ಷರತ್ತುಗಳನ್ನು ಅನುಸರಿಸಬೇಕು, ಇಲ್ಲದಿದ್ದರೆ ಅದು ಸುಲಭವಾಗಿ ವಿಫಲಗೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ದೈಹಿಕ ಕಾರಣಗಳು: ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಗೆ ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಬಹಳ ಮುಖ್ಯ. ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ತಾಪಮಾನವು ಕಡಿಮೆಯಿದ್ದರೆ ಮತ್ತು ಡಿನಾಟರೇಶನ್ ಸಮಯವು ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ, ತಪ್ಪು ನಿರಾಕರಣೆಗಳು ಸಂಭವಿಸುವ ಸಾಧ್ಯತೆಯಿದೆ; ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ, ಇದು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿದೆ. ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗಳಿಗೆ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಬಂಧಿಸುವುದನ್ನು ಹೆಚ್ಚು ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯ ದಕ್ಷತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡುತ್ತದೆ. ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಆಂಪ್ಲಿಫಯರ್ ಅಥವಾ ನೀರಿನಲ್ಲಿ ಕರಗುವ ಮಡಕೆಯಲ್ಲಿ ಡಿನಾಟರೇಶನ್, ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣೆಯ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಪರೀಕ್ಷಿಸಲು ಪ್ರಮಾಣಿತ ಥರ್ಮಾಮೀಟರ್ ಅನ್ನು ಬಳಸುವುದು ಅವಶ್ಯಕ. ಪಿಸಿಆರ್ ವೈಫಲ್ಯಕ್ಕೆ ಇದೂ ಒಂದು ಕಾರಣ. ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ವ್ಯತ್ಯಾಸ: ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್ ಮ್ಯುಟೇಟೆಡ್ ಅಥವಾ ಡಿಲೀಟ್ ಆಗಿದ್ದರೆ, ಇದು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ಗೆ ಪ್ರೈಮರ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಬೈಂಡಿಂಗ್ ಮೇಲೆ ಪರಿಣಾಮ ಬೀರುತ್ತದೆ ಅಥವಾ ಟಾರ್ಗೆಟ್ ಸೀಕ್ವೆನ್ಸ್‌ನ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ವಿಭಾಗದ ಅಳಿಸುವಿಕೆಯಿಂದಾಗಿ ಪ್ರೈಮರ್ ಮತ್ತು ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್ ಪೂರಕ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಕಳೆದುಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ, ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆ ಯಶಸ್ವಿಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ.
2.false ಧನಾತ್ಮಕ ಗೋಚರಿಸುವ PCR ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುತ್ತದೆ ಮತ್ತು ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಬ್ಯಾಂಡ್ ಹೆಚ್ಚು ಕ್ರಮಬದ್ಧ ಮತ್ತು ಪ್ರಕಾಶಮಾನವಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಸೂಕ್ತವಲ್ಲದ ಪ್ರೈಮರ್ ವಿನ್ಯಾಸ: ಆಯ್ದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಅನುಕ್ರಮವು ಗುರಿಯಲ್ಲದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಅನುಕ್ರಮದೊಂದಿಗೆ ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿದೆ, ಆದ್ದರಿಂದ ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯನ್ನು ನಿರ್ವಹಿಸುವಾಗ, ವರ್ಧಿತ ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನವು ಗುರಿಯಲ್ಲದ ಅನುಕ್ರಮವಾಗಿದೆ. ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮವು ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ ಅಥವಾ ಪ್ರೈಮರ್ ತುಂಬಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದ್ದರೆ, ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕತೆಗಳು ಸುಲಭವಾಗಿ ಸಂಭವಿಸಬಹುದು. ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಮರುವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಬೇಕಾಗಿದೆ. ಗುರಿ ಅನುಕ್ರಮಗಳು ಅಥವಾ ವರ್ಧನೆಯ ಉತ್ಪನ್ನಗಳ ಅಡ್ಡ-ಮಾಲಿನ್ಯ: ಈ ಮಾಲಿನ್ಯಕ್ಕೆ ಎರಡು ಕಾರಣಗಳಿವೆ: ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಸಂಪೂರ್ಣ ಜೀನೋಮ್ ಅಥವಾ ದೊಡ್ಡ ತುಣುಕುಗಳ ಅಡ್ಡ-ಮಾಲಿನ್ಯ, ಇದು ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ. ಈ ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕತೆಯನ್ನು ಈ ಕೆಳಗಿನ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಪರಿಹರಿಸಬಹುದು: ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮವನ್ನು ಮಾದರಿ ಗನ್‌ಗೆ ಹೀರಿಕೊಳ್ಳುವುದನ್ನು ತಡೆಯಲು ಅಥವಾ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ನಿಂದ ಸ್ಪ್ಲಾಶ್ ಮಾಡುವುದನ್ನು ತಡೆಯಲು ಕಾರ್ಯನಿರ್ವಹಿಸುವಾಗ ಜಾಗರೂಕರಾಗಿರಿ ಮತ್ತು ಮೃದುವಾಗಿರಿ. ಹೆಚ್ಚಿನ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ತಡೆದುಕೊಳ್ಳಲು ಸಾಧ್ಯವಿಲ್ಲದ ಕಿಣ್ವಗಳು ಮತ್ತು ಪದಾರ್ಥಗಳನ್ನು ಹೊರತುಪಡಿಸಿ, ಎಲ್ಲಾ ಕಾರಕಗಳು ಅಥವಾ ಉಪಕರಣಗಳನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿನ ಒತ್ತಡದಿಂದ ಕ್ರಿಮಿನಾಶಕಗೊಳಿಸಬೇಕು. ಎಲ್ಲಾ ಕೇಂದ್ರಾಪಗಾಮಿ ಟ್ಯೂಬ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ಮಾದರಿ ಇಂಜೆಕ್ಷನ್ ಪೈಪೆಟ್ ಸುಳಿವುಗಳನ್ನು ಒಮ್ಮೆ ಬಳಸಬೇಕು. ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ, ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳನ್ನು ನಾಶಮಾಡಲು ಮಾದರಿಯನ್ನು ಸೇರಿಸುವ ಮೊದಲು ಪ್ರತಿಕ್ರಿಯೆ ಕೊಳವೆಗಳು ಮತ್ತು ಕಾರಕಗಳನ್ನು ನೇರಳಾತೀತ ಬೆಳಕಿನಿಂದ ವಿಕಿರಣಗೊಳಿಸಲಾಗುತ್ತದೆ. ಎರಡನೆಯದು ಗಾಳಿಯಲ್ಲಿ ನ್ಯೂಕ್ಲಿಯಿಕ್ ಆಮ್ಲಗಳ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳ ಮಾಲಿನ್ಯವಾಗಿದೆ. ಈ ಸಣ್ಣ ತುಣುಕುಗಳು ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕಿಂತ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿದೆ, ಆದರೆ ಕೆಲವು ಹೋಮಾಲಜಿಯನ್ನು ಹೊಂದಿವೆ. ಅವುಗಳನ್ನು ಪರಸ್ಪರ ವಿಭಜಿಸಬಹುದು, ಮತ್ತು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳಿಗೆ ಪೂರಕವಾದ ನಂತರ, ಪಿಸಿಆರ್ ಉತ್ಪನ್ನಗಳನ್ನು ವರ್ಧಿಸಬಹುದು, ಇದು ತಪ್ಪು ಧನಾತ್ಮಕತೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗುತ್ತದೆ, ಇದನ್ನು ನೆಸ್ಟೆಡ್ ಪಿಸಿಆರ್ ವಿಧಾನಗಳಿಂದ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಬಹುದು ಅಥವಾ ತೆಗೆದುಹಾಕಬಹುದು.
3. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಗೋಚರಿಸುತ್ತವೆ PCR ವರ್ಧನೆಯ ನಂತರ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುವ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ನಿರೀಕ್ಷಿತ ಗಾತ್ರಕ್ಕೆ ಹೊಂದಿಕೆಯಾಗುವುದಿಲ್ಲ, ದೊಡ್ಡದಾಗಿರಬಹುದು ಅಥವಾ ಚಿಕ್ಕದಾಗಿರಬಹುದು ಅಥವಾ ನಿರ್ದಿಷ್ಟ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಮತ್ತು ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಆಂಪ್ಲಿಫಿಕೇಶನ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಒಂದೇ ಸಮಯದಲ್ಲಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತವೆ. ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳ ಗೋಚರಿಸುವಿಕೆಯ ಕಾರಣಗಳು: ಮೊದಲನೆಯದಾಗಿ, ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಗುರಿಯ ಅನುಕ್ರಮಕ್ಕೆ ಸಂಪೂರ್ಣವಾಗಿ ಪೂರಕವಾಗಿರುವುದಿಲ್ಲ ಅಥವಾ ಡೈಮರ್‌ಗಳನ್ನು ರೂಪಿಸಲು ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳು ಒಟ್ಟುಗೂಡುತ್ತವೆ. ಎರಡನೆಯ ಕಾರಣವೆಂದರೆ Mg2+ ಅಯಾನ್ ಸಾಂದ್ರತೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ, ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವು ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆಯಾಗಿದೆ ಮತ್ತು PCR ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯು ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಾಗಿರುತ್ತದೆ. ಎರಡನೆಯ ಅಂಶವೆಂದರೆ ಕಿಣ್ವದ ಗುಣಮಟ್ಟ ಮತ್ತು ಪ್ರಮಾಣ. ಕೆಲವು ಮೂಲಗಳಿಂದ ಬರುವ ಕಿಣ್ವಗಳು ಸಾಮಾನ್ಯವಾಗಿ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳಿಗೆ ಗುರಿಯಾಗುತ್ತವೆ ಆದರೆ ಇತರ ಮೂಲಗಳಿಂದ ಕಿಣ್ವಗಳು ಹಾಗೆ ಮಾಡುವುದಿಲ್ಲ. ಹೆಚ್ಚಿನ ಪ್ರಮಾಣದ ಕಿಣ್ವಗಳು ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ನಿರ್ದಿಷ್ಟವಲ್ಲದ ವರ್ಧನೆಗೆ ಕಾರಣವಾಗಬಹುದು. ಪ್ರತಿಕ್ರಮಗಳು ಸೇರಿವೆ: ಅಗತ್ಯವಿದ್ದರೆ ಪ್ರೈಮರ್ಗಳನ್ನು ಮರುವಿನ್ಯಾಸಗೊಳಿಸಿ. ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ ಅಥವಾ ಇನ್ನೊಂದು ಮೂಲದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ. ಪ್ರೈಮರ್‌ಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ, ಟೆಂಪ್ಲೇಟ್‌ನ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ ಮತ್ತು ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ. ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನವನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿಸಿ ಅಥವಾ ಎರಡು-ತಾಪಮಾನ ಬಿಂದು ವಿಧಾನವನ್ನು ಬಳಸಿ (93 ° C ನಲ್ಲಿ ಡಿನಾಟರೇಶನ್, 65 ° C ಸುತ್ತ ಅನೆಲಿಂಗ್ ಮತ್ತು ವಿಸ್ತರಣೆ).
4.ಫ್ಲೇಕಿ ಡ್ರ್ಯಾಗ್ ಅಥವಾ ಸ್ಮೀಯರ್‌ಗಳು ಪಿಸಿಆರ್ ವರ್ಧನೆಯು ಕೆಲವೊಮ್ಮೆ ಸ್ಮೀಯರ್ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು, ಶೀಟ್ ತರಹದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳು ಅಥವಾ ಕಾರ್ಪೆಟ್ ತರಹದ ಬ್ಯಾಂಡ್‌ಗಳಾಗಿ ಕಾಣಿಸಿಕೊಳ್ಳುತ್ತದೆ. ಕಾರಣಗಳು ಹೆಚ್ಚಾಗಿ ಹೆಚ್ಚಿನ ಕಿಣ್ವ ಅಥವಾ ಕಿಣ್ವದ ಕಳಪೆ ಗುಣಮಟ್ಟ, ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿನ dNTP ಸಾಂದ್ರತೆ, ತುಂಬಾ ಹೆಚ್ಚಿನ Mg2 + ಸಾಂದ್ರತೆ, ತುಂಬಾ ಕಡಿಮೆ ಅನೆಲಿಂಗ್ ತಾಪಮಾನ, ಮತ್ತು ಹಲವಾರು ಚಕ್ರಗಳಿಂದ ಉಂಟಾಗುತ್ತವೆ. ಪ್ರತಿಕ್ರಮಗಳು ಸೇರಿವೆ: ① ಕಿಣ್ವದ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ, ಅಥವಾ ಕಿಣ್ವವನ್ನು ಮತ್ತೊಂದು ಮೂಲದೊಂದಿಗೆ ಬದಲಾಯಿಸಿ. ②dNTP ಯ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ. Mg2+ ಸಾಂದ್ರತೆಯನ್ನು ಸೂಕ್ತವಾಗಿ ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ. ಟೆಂಪ್ಲೆಟ್ಗಳ ಪ್ರಮಾಣವನ್ನು ಹೆಚ್ಚಿಸಿ ಮತ್ತು ಚಕ್ರಗಳ ಸಂಖ್ಯೆಯನ್ನು ಕಡಿಮೆ ಮಾಡಿ
