PCR FAQ 1. អវិជ្ជមានមិនពិត គ្មានក្រុម amplification លេចឡើង 2. False positive 3. non-specific amplification bands លេចឡើង 4. Flaky drag strips ឬ smear strips លេចឡើង:
1False negative, no amplified band លេចឡើង ទិដ្ឋភាពសំខាន់នៃប្រតិកម្ម PCR គឺ
① ការរៀបចំអាស៊ីត nucleic គំរូ
② គុណភាពនិងភាពជាក់លាក់
③ គុណភាពអង់ស៊ីម និង
④ លក្ខខណ្ឌនៃវដ្ត PCR ។ ដើម្បីស្វែងរកមូលហេតុ ការវិភាគ និងស្រាវជ្រាវក៏គួរតែធ្វើឡើងនៅលើតំណភ្ជាប់ខាងលើផងដែរ។
គំរូ៖
① គំរូមានប្រូតេអ៊ីនមិនបរិសុទ្ធ
② គំរូមានផ្ទុកអង់ស៊ីម Taq inhibitors
③ ប្រូតេអ៊ីននៅក្នុងគំរូមិនត្រូវបានរំលាយ និងដកចេញទេ ជាពិសេសអ៊ីស្តូននៅក្នុងក្រូម៉ូសូម
④ ការបាត់បង់ច្រើនពេកក្នុងអំឡុងពេលស្រង់ចេញ និងការរៀបចំគំរូ ឬ phenol ត្រូវបានស្រូបចូល
⑤អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគំរូមិនមានលក្ខណៈពេញលេញទេ។ នៅពេលដែលគុណភាពនៃអង់ស៊ីម និងសារធាតុ primers ល្អ ប្រសិនបើក្រុម amplification មិនលេចឡើង វាទំនងជាមានអ្វីមួយខុសជាមួយនឹងដំណើរការរំលាយអាហារនៃគំរូ ឬដំណើរការទាញយកអាស៊ីត nucleic គំរូ។ ដូច្នេះដំណោះស្រាយការរំលាយអាហារដែលមានប្រសិទ្ធភាពនិងមានស្ថេរភាពត្រូវតែត្រូវបានរៀបចំហើយនីតិវិធីគួរតែត្រូវបានជួសជុលហើយមិនគួរត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរតាមឆន្ទៈ។ . អង់ស៊ីមអសកម្ម៖ ចាំបាច់ត្រូវជំនួសអង់ស៊ីមថ្មី ឬប្រើអង់ស៊ីមចាស់ និងថ្មីក្នុងពេលតែមួយ ដើម្បីវិភាគថាតើអវិជ្ជមានក្លែងក្លាយបណ្តាលមកពីការបាត់បង់ ឬសកម្មភាពអង់ស៊ីមមិនគ្រប់គ្រាន់។ វាគួរតែត្រូវបានកត់សម្គាល់ថាជួនកាលអង់ស៊ីម Taq ត្រូវបានបំភ្លេចចោល។Primers: គុណភាព primer ការផ្តោតអារម្មណ៍ primer និងថាតើការប្រមូលផ្តុំនៃ primers ទាំងពីរមានភាពស៊ីមេទ្រីគឺជាហេតុផលទូទៅសម្រាប់ការបរាជ័យ PCR ឬ bands amplification មិនពេញចិត្ត និងការសាយភាយងាយស្រួល។ មានបញ្ហាជាមួយនឹងគុណភាពនៃការសំយោគ primer នៅក្នុងបាច់មួយចំនួន។ មួយក្នុងចំនោម primers ទាំងពីរមានកំហាប់ខ្ពស់ ហើយមួយទៀតមានកំហាប់ទាប ដែលធ្វើអោយ amplification asymmetric មានប្រសិទ្ធភាពទាប។
វិធានការប្រឆាំងគឺ៖
① ជ្រើសរើសឯកតាសំយោគបឋមល្អ។
② ការផ្តោតអារម្មណ៍នៃ primers មិនគួរមើលត្រឹមតែតម្លៃ OD ប៉ុណ្ណោះទេ ប៉ុន្តែថែមទាំងយកចិត្តទុកដាក់ចំពោះដំណោះស្រាយ primer stock សម្រាប់ agarose gel electrophoresis ផងដែរ។ ត្រូវតែមានស្រទាប់ primer ហើយពន្លឺនៃ primer bands ទាំងពីរគួរតែមានប្រហែលដូចគ្នា។ ឧទាហរណ៍ primer មួយមាន band ហើយ primer ផ្សេងទៀតមិនមាន band ។ សម្រាប់បន្ទះ PCR អាចនឹងបរាជ័យនៅពេលនេះ ហើយគួរតែត្រូវបានដោះស្រាយតាមរយៈការចរចាជាមួយអង្គភាពសំយោគបឋម។ ប្រសិនបើ primer មួយមានពន្លឺខ្ពស់ ហើយមួយទៀតមានពន្លឺទាប ធ្វើឱ្យមានតុល្យភាពរវាងការប្រមូលផ្តុំនៅពេល diluting primers ។
③ primers គួរតែត្រូវបានរក្សាទុកក្នុងកំហាប់ខ្ពស់ និងក្នុងបរិមាណតិចតួច ដើម្បីការពារការកកម្តងហើយម្តងទៀត និងការរលាយ ឬការផ្ទុករយៈពេលវែងនៅក្នុងទូទឹកកក ដែលអាចនាំអោយ primers ខូច និងរិចរិល។
④ ការរចនា primer គឺមិនសមហេតុផលទេ ដូចជាប្រវែង primer គឺមិនគ្រប់គ្រាន់ dimers ត្រូវបានបង្កើតឡើងរវាង primers ជាដើម។ ប្រសិនបើកំហាប់ខ្ពស់ពេក វាអាចកាត់បន្ថយភាពជាក់លាក់នៃការពង្រីក PCR ។ ប្រសិនបើកំហាប់ទាបពេក វានឹងប៉ះពាល់ដល់ទិន្នផលពង្រីក PCR ហើយថែមទាំងធ្វើឱ្យ PCR amplification បរាជ័យដោយមិនបាច់ពង្រីក។ ការផ្លាស់ប្តូរបរិមាណប្រតិកម្ម៖ ជាធម្មតាបរិមាណដែលប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR គឺ 20ul, 30ul និង 50ul។ ឬ 100ul តើបរិមាណអ្វីដែលគួរប្រើសម្រាប់ការពង្រីក PCR ត្រូវបានកំណត់ដោយគោលបំណងផ្សេងគ្នានៃការស្រាវជ្រាវវិទ្យាសាស្ត្រ និងការធ្វើតេស្តគ្លីនិក។ បន្ទាប់ពីធ្វើបរិមាណតូចមួយដូចជា 20ul ហើយបន្ទាប់មកធ្វើឱ្យបរិមាណធំជាងនេះអ្នកត្រូវតែធ្វើតាមលក្ខខណ្ឌបើមិនដូច្នេះទេវានឹងបរាជ័យយ៉ាងងាយស្រួល។ ហេតុផលរូបវន្ត៖ ការប្រែពណ៌មានសារៈសំខាន់ខ្លាំងណាស់សម្រាប់ការពង្រីក PCR ។ ប្រសិនបើសីតុណ្ហភាព denaturation មានកម្រិតទាប ហើយរយៈពេល denaturation គឺខ្លី អវិជ្ជមានមិនពិតទំនងជានឹងកើតឡើង។ សីតុណ្ហភាព annealing គឺទាបពេកដែលអាចបណ្តាលឱ្យ amplification មិនជាក់លាក់និងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព amplification ជាក់លាក់។ សីតុណ្ហភាពនៃការដុតគឺខ្ពស់ពេក។ ប៉ះពាល់យ៉ាងខ្លាំងដល់ការចងនៃ primers ទៅនឹងគំរូ និងកាត់បន្ថយប្រសិទ្ធភាព PCR amplification ។ ពេលខ្លះ ចាំបាច់ត្រូវប្រើទែម៉ូម៉ែត្រស្តង់ដារ ដើម្បីពិនិត្យមើលសីតុណ្ហភាព denaturation, annealing និង extension នៅក្នុង amplifier ឬ pot-soluble pot។ នេះក៏ជាហេតុផលមួយសម្រាប់ការបរាជ័យ PCR ។ បំរែបំរួលនៃលំដាប់គោលដៅ៖ ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅត្រូវបានផ្លាស់ប្តូរ ឬលុប ដែលប៉ះពាល់ដល់ការភ្ជាប់ជាក់លាក់នៃ primer ទៅគំរូ ឬ primer និង template បាត់បង់លំដាប់បំពេញបន្ថែមដោយសារតែការលុបផ្នែកជាក់លាក់នៃលំដាប់គោលដៅនោះ PCR amplification នឹងមិនជោគជ័យទេ។
2.false positive ក្រុម PCR amplification band ដែលលេចឡើងគឺស្របជាមួយនឹងក្រុមតន្រ្តីលំដាប់គោលដៅ ហើយជួនកាលក្រុមតន្រ្តីមានសណ្តាប់ធ្នាប់ និងភ្លឺជាង។ ការរចនាបឋមមិនសមរម្យ៖ លំដាប់ amplification ដែលបានជ្រើសរើសមានភាពដូចគ្នាជាមួយនឹងលំដាប់ amplification ដែលមិនមែនជាគោលដៅ ដូច្នេះនៅពេលអនុវត្ត PCR amplification ផលិតផល PCR amplified គឺជាលំដាប់ដែលមិនមែនជាគោលដៅ។ ប្រសិនបើលំដាប់គោលដៅខ្លីពេក ឬបឋមខ្លីពេក ភាពវិជ្ជមានមិនពិតអាចកើតឡើងយ៉ាងងាយ។ Primers ត្រូវការការរចនាឡើងវិញ។ ការចម្លងមេរោគឆ្លងតាមលំដាប់គោលដៅ ឬផលិតផលពង្រីក៖ មានហេតុផលពីរសម្រាប់ការចម្លងរោគនេះ៖ ទីមួយ ការចម្លងមេរោគឆ្លងនៃហ្សែនទាំងមូល ឬបំណែកធំ ដែលនាំទៅរកភាពវិជ្ជមានមិនពិត។ ភាពវិជ្ជមានមិនពិតនេះអាចត្រូវបានដោះស្រាយដោយវិធីសាស្រ្តដូចខាងក្រោមៈ ត្រូវប្រុងប្រយ័ត្ន និងសុភាពរាបសារនៅពេលប្រតិបត្តិការ ដើម្បីការពារលំដាប់គោលដៅពីការជញ្ជក់ចូលទៅក្នុងកាំភ្លើងគំរូ ឬខ្ទាតចេញពីបំពង់ centrifuge ។ លើកលែងតែអង់ស៊ីម និងសារធាតុដែលមិនអាចទប់ទល់នឹងសីតុណ្ហភាពខ្ពស់ សារធាតុប្រតិកម្ម ឬឧបករណ៍ទាំងអស់គួរតែត្រូវបានក្រៀវដោយសម្ពាធខ្ពស់។ បំពង់ centrifuge ទាំងអស់ និងគន្លឹះចាក់ថ្នាំគំរូគួរតែត្រូវបានប្រើម្តង។ បើចាំបាច់ បំពង់ប្រតិកម្ម និងសារធាតុ reagents ត្រូវបាន irradiated ជាមួយពន្លឺ ultraviolet មុនពេលបន្ថែមសំណាកដើម្បីបំផ្លាញអាស៊ីត nucleic ដែលមានវត្តមាន។ ទីពីរគឺការចម្លងរោគនៃបំណែកតូចៗនៃអាស៊ីត nucleic នៅក្នុងខ្យល់។ បំណែកតូចៗទាំងនេះខ្លីជាងលំដាប់គោលដៅ ប៉ុន្តែមានភាពដូចគ្នាជាក់លាក់។ ពួកវាអាចផ្សាភ្ជាប់គ្នាទៅវិញទៅមក ហើយបន្ទាប់ពីត្រូវបានបំពេញបន្ថែមទៅនឹងថ្នាំ primers ផលិតផល PCR អាចត្រូវបានពង្រីក ដែលបណ្តាលឱ្យមានភាពវិជ្ជមានមិនពិត ដែលអាចត្រូវបានកាត់បន្ថយ ឬលុបបំបាត់ដោយវិធីសាស្ត្រ PCR ដែលត្រូវបានដាក់។
3.Non-specific amplification bands លេចឡើង ក្រុមតន្រ្តីដែលលេចឡើងបន្ទាប់ពីការពង្រីក PCR គឺមិនស៊ីគ្នានឹងទំហំដែលរំពឹងទុក ទាំងធំជាង ឬតូចជាង ឬទាំងពីរក្រុម amplification ជាក់លាក់ និងក្រុម amplification មិនជាក់លាក់លេចឡើងក្នុងពេលតែមួយ។ ហេតុផលសម្រាប់ការលេចឡើងនៃក្រុមតន្រ្តីមិនជាក់លាក់គឺ: ទីមួយ primers មិនត្រូវបានបំពេញបន្ថែមទាំងស្រុងទៅនឹងលំដាប់គោលដៅឬ primers សរុបដើម្បីបង្កើត dimers ។ មូលហេតុទីពីរគឺថាកំហាប់អ៊ីយ៉ុង Mg2+ ខ្ពស់ពេក សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក ហើយចំនួននៃវដ្ត PCR គឺខ្ពស់ពេក។ កត្តាទីពីរគឺគុណភាព និងបរិមាណនៃអង់ស៊ីម។ អង់ស៊ីមពីប្រភពមួយចំនួន ច្រើនតែងាយនឹងក្រុមមិនជាក់លាក់ ប៉ុន្តែអង់ស៊ីមពីប្រភពផ្សេងទៀតមិនមានទេ។ បរិមាណអង់ស៊ីមច្រើនពេក ជួនកាលអាចនាំទៅរកការពង្រីកមិនជាក់លាក់។ វិធានការតបតរួមមានៈ រៀបចំឡើងវិញនូវ primers បើចាំបាច់។ កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬជំនួសវាដោយប្រភពផ្សេងទៀត។ កាត់បន្ថយបរិមាណ primers បង្កើនបរិមាណនៃគំរូឱ្យបានត្រឹមត្រូវនិងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត។ បង្កើនសីតុណ្ហភាព annealing ឱ្យសមស្រប ឬប្រើវិធីពីរ-temperature point (denaturation at 93°C, annealing and extension around 65°C)។
4. ការអូស ឬស្នាមប្រេះលេចឡើង ជួនកាល PCR amplification លេចឡើងជាបន្ទះដែលលាបពណ៌ បន្ទះដូចសន្លឹក ឬខ្សែដូចកំរាលព្រំ។ ហេតុផលជារឿយៗបណ្តាលមកពីអង់ស៊ីមច្រើនពេក ឬគុណភាពអន់នៃអង់ស៊ីម កំហាប់ dNTP ខ្ពស់ពេក កំហាប់ Mg2+ ខ្ពស់ពេក សីតុណ្ហភាព annealing ទាបពេក និងវដ្តច្រើនពេក។ វិធានការប្រឆាំងរួមមានៈ ① កាត់បន្ថយបរិមាណអង់ស៊ីម ឬជំនួសអង់ស៊ីមជាមួយប្រភពផ្សេងទៀត។ ②កាត់បន្ថយការប្រមូលផ្តុំ dNTP ។ កាត់បន្ថយកំហាប់ Mg2+ ឱ្យបានត្រឹមត្រូវ។ បង្កើនចំនួនគំរូ និងកាត់បន្ថយចំនួនវដ្ត
