ПТР жиі қойылатын сұрақтар 1. Жалған теріс, күшейту жолағы жоқ 2. Жалған оң 3. Арнайы емес күшейту жолақтары пайда болады 4. Қабыршақты сүйреу жолақтары немесе жағылу жолақтары пайда болады:
1Жалған теріс, күшейтілген жолақ пайда болмайды ПТР реакциясының негізгі аспектілері
① шаблонды нуклеин қышқылын дайындау
② праймер сапасы мен ерекшелігі
③ фермент сапасы және
④ ПТР циклінің шарттары. Себептерді табу үшін жоғарыда аталған сілтемелер бойынша талдаулар мен зерттеулер жүргізілуі керек.
Үлгі:
① Үлгіде қоспа ақуыздары бар
② Үлгіде Taq ферментінің ингибиторлары бар
③ Үлгідегі белоктар қорытылмайды және жойылмайды, әсіресе хромосомалардағы гистондар
④ Үлгіні алу және дайындау кезінде тым көп жоғалған немесе фенол ингаляцияланған
⑤ Үлгі нуклеин қышқылы толық денатурацияланбаған. Ферменттердің және праймерлердің сапасы жақсы болған кезде, күшейту жолақтары пайда болмаса, үлгіні қорыту процесінде немесе үлгі нуклеин қышқылын алу процесінде бірдеңе дұрыс емес болуы мүмкін. Сондықтан тиімді және тұрақты ас қорыту ерітіндісін дайындау керек, ал процедураны бекіту керек және өз қалауы бойынша өзгертуге болмайды. . Ферментті инактивациялау: жаңа ферментті ауыстыру керек немесе жалған негативтердің ферменттің жоғалуынан немесе жеткіліксіз белсенділігінен туындағанын талдау үшін бір уақытта ескі және жаңа ферменттерді пайдалану қажет. Айта кету керек, кейде Taq ферменті ұмытылады.Праймерлер: праймер сапасы, праймер концентрациясы және екі праймердің концентрацияларының симметриялы болуы ПТР сәтсіздігінің немесе қанағаттанарлықсыз күшейту жолақтары мен жеңіл диффузияның жалпы себептері болып табылады. Кейбір партияларда праймер синтезінің сапасына қатысты мәселелер бар. Екі праймердің біреуі жоғары концентрацияға ие, ал екіншісі төмен концентрацияға ие, нәтижесінде төмен тиімді асимметриялық күшейту болады.
Қарсы шаралар мыналар:
① Жақсы праймер синтезі бірлігін таңдаңыз.
② Праймерлердің концентрациясы тек OD мәніне қарап қана қоймай, агарозды гель электрофорезіне арналған праймер қоры ерітіндісіне де назар аударуы керек. Праймер жолақтары болуы керек және екі праймер жолағының жарықтығы шамамен бірдей болуы керек. Мысалы, бір праймерде жолақ бар, ал екіншісінде жолақ жоқ. Жолақтар үшін ПТР осы уақытта сәтсіз болуы мүмкін және оны праймер синтезі блогымен келіссөздер арқылы шешу керек. Бір праймердің жарықтығы жоғары болса, екіншісінің жарықтығы төмен болса, праймерлерді сұйылтқан кезде концентрацияларды теңестіріңіз.
③ Праймерлерді қайта-қайта мұздату мен ерітуді немесе тоңазытқышта ұзақ сақтауды болдырмау үшін жоғары концентрацияда және аз мөлшерде сақтау керек, бұл праймерлердің нашарлауына және тозуына әкелуі мүмкін.
④Праймер дизайны негізсіз, мысалы, праймер ұзындығы жеткіліксіз, праймерлер арасында димерлер түзіледі және т.б. Mg2+ концентрациясы: Mg2+ ионының концентрациясы ПТР күшейту тиімділігіне үлкен әсер етеді. Егер концентрация тым жоғары болса, ол ПТР күшейту ерекшелігін төмендетуі мүмкін. Егер концентрация тым төмен болса, ол ПТР күшейту шығымына әсер етеді және тіпті жолақтарды күшейтпей ПТР күшейту сәтсіз аяқталады. Реакция көлемінің өзгеруі: Әдетте ПТР күшейту үшін пайдаланылатын көлемдер 20ul, 30ul және 50ul болып табылады. Немесе 100ul, ПТР күшейту үшін қандай көлемді қолдану керектігі ғылыми зерттеулер мен клиникалық сынақтардың әртүрлі мақсаттарына сәйкес белгіленеді. 20ул сияқты шағын көлемді жасап, одан кейін үлкенірек көлемді жасағаннан кейін сіз шарттарды орындауыңыз керек, әйтпесе ол оңай істен шығады. Физикалық себептер: ПТР күшейту үшін денатурация өте маңызды. Егер денатурация температурасы төмен және денатурация уақыты қысқа болса, жалған негативтердің пайда болу ықтималдығы өте жоғары; күйдіру температурасы тым төмен, бұл спецификалық емес күшейтуді тудыруы және күшейтудің меншікті тиімділігін төмендетуі мүмкін. Жасыту температурасы тым жоғары. Праймерлердің шаблондармен байланысуына жоғары әсер етеді және ПТР күшейту тиімділігін төмендетеді. Кейде күшейткіштегі немесе суда еритін кастрюльдегі денатурация, күйдіру және ұзарту температураларын тексеру үшін стандартты термометрді пайдалану қажет. Бұл да ПТР сәтсіздігінің себептерінің бірі. Мақсатты тізбектің вариациясы: егер мақсатты реттілік мутацияға ұшыраса немесе жойылса, бұл праймердің шаблонмен нақты байланысуына әсер етсе немесе праймер мен шаблон мақсатты тізбектің белгілі бір сегментінің жойылуына байланысты қосымша реттілігін жоғалтса, ПТР күшейту табысты болмайды.
2.жалған оң Пайда болған ПТР күшейту жолағы мақсатты реттілік жолағына сәйкес келеді, ал кейде жолақ реттелген және жарқынырақ болады. Сәйкес емес праймер дизайны: таңдалған күшейту тізбегі мақсатты емес күшейту ретімен гомологияға ие, сондықтан ПТР күшейтуді орындаған кезде күшейтілген ПТР өнімі мақсатты емес реттілік болып табылады. Мақсатты реттілік тым қысқа немесе праймер тым қысқа болса, жалған позитивтер оңай пайда болуы мүмкін. Праймерлерді қайта өңдеу қажет. Мақсатты тізбектердің немесе күшейту өнімдерінің өзара ластануы: Бұл ластанудың екі себебі бар: Біріншіден, жалған позитивтерге әкелетін бүкіл геномның немесе үлкен фрагменттердің айқас ластануы. Бұл жалған позитивті келесі әдістермен шешуге болады: Нысаналы тізбектің үлгі пистолетіне сорылуын немесе центрифуга түтігінен шашырауын болдырмау үшін жұмыс істегенде абай және жұмсақ болыңыз. Жоғары температураға төтеп бере алмайтын ферменттер мен заттарды қоспағанда, барлық реагенттер немесе жабдықтар жоғары қысыммен зарарсыздандырылуы керек. Барлық центрифуга түтіктері мен үлгі инъекциялық тамшуыр ұштарын бір рет пайдалану керек. Қажет болса, реакция түтіктері мен реагенттер бар нуклеин қышқылдарын жою үшін үлгіні қоспас бұрын ультракүлгін сәулемен сәулелендіріледі. Екіншісі – ауадағы нуклеин қышқылдарының ұсақ фрагменттерінің ластануы. Бұл шағын фрагменттер мақсатты тізбектен қысқа, бірақ белгілі бір гомологияға ие. Оларды бір-біріне қосуға болады және праймерлерге қосымша болғаннан кейін ПТР өнімдерін күшейтуге болады, нәтижесінде жалған позитивтер пайда болады, оларды кірістірілген ПТР әдістерімен азайтуға немесе жоюға болады.
3. Арнайы емес күшейту жолақтары пайда болады ПТР күшейтуден кейін пайда болатын жолақтар күтілетін өлшемге сәйкес келмейді, үлкенірек немесе кішірек немесе арнайы күшейту жолақтары мен арнайы емес күшейту жолақтары бір уақытта пайда болады. Арнайы емес жолақтардың пайда болу себептері: біріншіден, праймерлер мақсатты реттілікке толықтай қосымша емес немесе праймерлер біріктіріліп, димерлерді құрайды. Екінші себеп Mg2+ ионының концентрациясы тым жоғары, күйдіру температурасы тым төмен және ПТР циклдарының саны тым жоғары. Екінші фактор – ферменттің сапасы мен саны. Кейбір көздерден алынған ферменттер көбінесе спецификалық емес жолақтарға бейім, бірақ басқа көздерден алынған ферменттер жоқ. Ферменттердің шамадан тыс мөлшері кейде спецификалық емес күшейтуге әкелуі мүмкін. Қарсы шаралар мыналарды қамтиды: қажет болған жағдайда праймерлерді қайта жасаңыз. Фермент мөлшерін азайтыңыз немесе оны басқа көзбен ауыстырыңыз. Праймерлердің мөлшерін азайтыңыз, үлгі мөлшерін сәйкесінше арттырыңыз және циклдар санын азайтыңыз. Жасыту температурасын сәйкесінше арттырыңыз немесе екі температуралық нүкте әдісін қолданыңыз (93°C денатурация, жасыту және шамамен 65°C ұзарту).
4. Кептіру немесе жағылу пайда болады ПТР күшейту кейде жағылған жолақтар, парақ тәрізді жолақтар немесе кілем тәрізді жолақтар түрінде көрінеді. Себептер көбінесе тым көп фермент немесе фермент сапасының төмендігі, тым жоғары dNTP концентрациясы, тым жоғары Mg2+ концентрациясы, тым төмен күйдіру температурасы және тым көп циклдардан туындайды. Қарсы шаралар мыналарды қамтиды: ① Фермент мөлшерін азайтыңыз немесе ферментті басқа көзбен ауыстырыңыз. ②dNTP концентрациясын төмендетіңіз. Mg2+ концентрациясын тиісінше төмендетіңіз. Үлгілердің санын көбейтіңіз және циклдар санын азайтыңыз
