PCR ხშირად დასმული კითხვები 1. ცრუ უარყოფითი, არ ჩანს გამაძლიერებელი ზოლები 2. ცრუ დადებითი 3. ჩნდება არასპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები 4. ჩნდება ქერცლიანი გადაწევის ზოლები ან ნაცხის ზოლები:

1 ცრუ უარყოფითი, გაძლიერებული ზოლი არ ჩანს PCR რეაქციის ძირითადი ასპექტებია

① შაბლონის ნუკლეინის მჟავის მომზადება

② პრაიმერის ხარისხი და სპეციფიკა

③ ფერმენტის ხარისხი და

④ PCR ციკლის პირობები. მიზეზების საპოვნელად ასევე უნდა ჩატარდეს ანალიზი და კვლევა ზემოაღნიშნულ ბმულებზე.

შაბლონი:

① შაბლონი შეიცავს მინარევის ცილებს

② შაბლონი შეიცავს Taq ფერმენტის ინჰიბიტორებს

③ შაბლონში არსებული ცილები არ იშლება და არ იშლება, განსაკუთრებით ქრომოსომებში არსებული ჰისტონები

④ შაბლონის მოპოვებისა და მომზადების დროს ძალიან ბევრი დაიკარგა, ან ფენოლი ჩაისუნთქა

⑤ შაბლონი ნუკლეინის მჟავა არ არის მთლიანად დენატურირებული. როდესაც ფერმენტების და პრაიმერების ხარისხი კარგია, თუ გამაძლიერებელი ზოლები არ გამოჩნდება, დიდი ალბათობით, რაღაც არასწორია ნიმუშის მონელების პროცესში ან შაბლონის ნუკლეინის მჟავას ექსტრაქციის პროცესში. ამიტომ უნდა მომზადდეს ეფექტური და სტაბილური საჭმლის მომნელებელი ხსნარი და პროცედურა უნდა დაფიქსირდეს და არ უნდა შეიცვალოს სურვილისამებრ. . ფერმენტის ინაქტივაცია: აუცილებელია ახალი ფერმენტის ჩანაცვლება, ან ძველი და ახალი ფერმენტების ერთდროულად გამოყენება იმის გასაანალიზებლად, არის თუ არა ცრუ უარყოფითი შედეგი გამოწვეული ფერმენტის დაკარგვით ან არასაკმარისი აქტივობით. უნდა აღინიშნოს, რომ ზოგჯერ Taq ფერმენტი დავიწყებულია. პრაიმერები: პრაიმერის ხარისხი, პრაიმერის კონცენტრაცია და სიმეტრიულია თუ არა ორი პრაიმერის კონცენტრაცია, არის თუ არა PCR წარუმატებლობის ან არადამაკმაყოფილებელი გამაძლიერებელი ზოლები და მარტივი დიფუზია. ზოგიერთ პარტიაში არის პრობლემები პრაიმერის სინთეზის ხარისხთან დაკავშირებით. ორი პრაიმერიდან ერთს აქვს მაღალი კონცენტრაცია, მეორეს კი დაბალი კონცენტრაცია, რაც იწვევს დაბალი ეფექტურობის ასიმეტრიულ გაძლიერებას.

საწინააღმდეგო ზომებია:

① აირჩიეთ კარგი პრაიმერის სინთეზის ერთეული.

② პრაიმერების კონცენტრაციამ არა მხოლოდ უნდა შეხედოს OD მნიშვნელობას, არამედ ყურადღება მიაქციოს პრაიმერის მარაგის ხსნარს აგაროზის გელის ელექტროფორეზისთვის. უნდა იყოს პრაიმერის ზოლები და ორი პრაიმერის ზოლის სიკაშკაშე დაახლოებით იგივე უნდა იყოს. მაგალითად, ერთ პრაიმერს აქვს ზოლი, ხოლო მეორე პრაიმერს არ აქვს ზოლი. ზოლებისთვის, PCR შეიძლება ამ დროს ვერ მოხერხდეს და უნდა გადაწყდეს პრაიმერის სინთეზის ერთეულთან მოლაპარაკების გზით. თუ ერთ პრაიმერს აქვს მაღალი სიკაშკაშე, ხოლო მეორეს აქვს დაბალი სიკაშკაშე, დააბალანსეთ კონცენტრაციები პრაიმერების განზავებისას.

③ პრაიმერები უნდა ინახებოდეს მაღალი კონცენტრაციით და მცირე რაოდენობით, რათა თავიდან იქნას აცილებული განმეორებითი გაყინვა და გალღობა ან მაცივარში ხანგრძლივი შენახვა, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს პრაიმერების გაფუჭება და დეგრადაცია.

④პრაიმერის დიზაინი არაგონივრულია, მაგალითად, პრაიმერის სიგრძე არ არის საკმარისი, პრაიმერებს შორის წარმოიქმნება დიმერები და ა.შ. Mg2+ კონცენტრაცია: Mg2+ იონის კონცენტრაცია დიდ გავლენას ახდენს PCR გაძლიერების ეფექტურობაზე. თუ კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, მას შეუძლია შეამციროს PCR ამპლიფიკაციის სპეციფიკა. თუ კონცენტრაცია ძალიან დაბალია, ეს გავლენას მოახდენს PCR გამაძლიერებლობის ეფექტურობაზე და გამოიწვევს PCR გაძლიერების წარუმატებლობას ზოლების გამაძლიერებლის გარეშე. რეაქციის მოცულობის ცვლილებები: ჩვეულებრივ, PCR გამაძლიერებლისთვის გამოყენებული მოცულობა არის 20 მულტი, 30 მულტი და 50 მულტი. ანუ 100ულლ, ​​რა მოცულობა უნდა იყოს გამოყენებული PCR-ის ამპლიფიკაციისთვის, დგინდება სამეცნიერო კვლევისა და კლინიკური ტესტირების სხვადასხვა მიზნების მიხედვით. მცირე მოცულობის გაკეთების შემდეგ, როგორიცაა 20ულ, და შემდეგ უფრო დიდი მოცულობის გაკეთების შემდეგ, უნდა დაიცვათ პირობები, წინააღმდეგ შემთხვევაში ის ადვილად ჩავარდება. ფიზიკური მიზეზები: დენატურაცია ძალიან მნიშვნელოვანია PCR ამპლიფიკაციისთვის. თუ დენატურაციის ტემპერატურა დაბალია და დენატურაციის დრო მოკლეა, ცრუ ნეგატივების დიდი ალბათობაა; ანეილირების ტემპერატურა ძალიან დაბალია, რამაც შეიძლება გამოიწვიოს არასპეციფიკური გაძლიერება და შეამციროს სპეციფიკური გაძლიერების ეფექტურობა. დადუღების ტემპერატურა ძალიან მაღალია. დიდ გავლენას ახდენს პრაიმერების შაბლონებთან დაკავშირებაზე და ამცირებს PCR გაძლიერების ეფექტურობას. ზოგჯერ საჭიროა სტანდარტული თერმომეტრის გამოყენება გამაძლიერებელში ან წყალში ხსნად ჭურჭელში დენატურაციის, ანეილირების და გაფართოების ტემპერატურის შესამოწმებლად. ეს ასევე არის PCR წარუმატებლობის ერთ-ერთი მიზეზი. სამიზნე თანმიმდევრობის ცვალებადობა: თუ სამიზნე თანმიმდევრობა შეიცვალა ან წაშლილია, რაც გავლენას ახდენს პრაიმერის სპეციფიკურ შეკავშირებაზე შაბლონთან, ან პრაიმერი და შაბლონი კარგავენ დამატებით თანმიმდევრობას სამიზნე თანმიმდევრობის გარკვეული სეგმენტის წაშლის გამო, PCR გაძლიერება. არ იქნება წარმატებული.

2. ცრუ დადებითი PCR გამაძლიერებელი ზოლი, რომელიც გამოჩნდება, შეესაბამება სამიზნე მიმდევრობის ზოლს და ზოგჯერ ზოლი უფრო მოწესრიგებული და ნათელია. პრაიმერის შეუსაბამო დიზაინი: შერჩეული ამპლიფიკაციის თანმიმდევრობა აქვს ჰომოლოგიას არასამიზნე გაძლიერების თანმიმდევრობასთან, ამიტომ PCR გაძლიერების შესრულებისას, გაძლიერებული PCR პროდუქტი არის არასამიზნე თანმიმდევრობა. თუ სამიზნე თანმიმდევრობა ძალიან მოკლეა ან პრაიმერი ძალიან მოკლეა, ცრუ დადებითი შეიძლება ადვილად მოხდეს. პრაიმერები საჭიროებს ხელახლა დიზაინს. სამიზნე თანმიმდევრობების ან ამპლიფიკაციის პროდუქტების ჯვარედინი დაბინძურება: ამ დაბინძურების ორი მიზეზი არსებობს: პირველი, მთელი გენომის ან დიდი ფრაგმენტების ჯვარედინი დაბინძურება, რაც იწვევს ცრუ დადებით შედეგებს. ეს ცრუ დადებითი შეიძლება გადაწყდეს შემდეგი მეთოდებით: იყავით ფრთხილად და ნაზად მუშაობისას, რათა თავიდან აიცილოთ სამიზნე თანმიმდევრობის შეწოვა სინჯის იარაღში ან ცენტრიფუგის მილიდან ამოფრქვევა. გარდა ფერმენტებისა და ნივთიერებებისა, რომლებიც ვერ უძლებენ მაღალ ტემპერატურას, ყველა რეაგენტი ან მოწყობილობა უნდა იყოს სტერილიზაცია მაღალი წნევით. ყველა ცენტრიფუგის მილი და ნიმუშის საინექციო პიპეტის წვერები უნდა იქნას გამოყენებული ერთხელ. საჭიროების შემთხვევაში, რეაქციის მილები და რეაგენტები დასხივდება ულტრაიისფერი შუქით, სანამ ნიმუში დაემატება, რათა გაანადგუროს არსებული ნუკლეინის მჟავები. მეორე არის ჰაერში ნუკლეინის მჟავების მცირე ფრაგმენტების დაბინძურება. ეს პატარა ფრაგმენტები უფრო მოკლეა, ვიდრე სამიზნე თანმიმდევრობა, მაგრამ აქვთ გარკვეული ჰომოლოგია. ისინი შეიძლება დაერთოს ერთმანეთს და პრაიმერების კომპლემენტაციის შემდეგ, PCR პროდუქტები შეიძლება გაძლიერდეს, რის შედეგადაც მიიღება ცრუ დადებითი, რომელიც შეიძლება შემცირდეს ან აღმოიფხვრას წყობილი PCR მეთოდებით.

 

3. ჩნდება არასპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები ზოლები, რომლებიც ჩნდება PCR გაძლიერების შემდეგ, არ შეესაბამება მოსალოდნელ ზომას, უფრო დიდი ან პატარა, ან ორივე სპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები და არასპეციფიკური გამაძლიერებელი ზოლები ერთდროულად გამოჩნდება. არასპეციფიკური ზოლების გამოჩენის მიზეზებია: ჯერ ერთი, პრაიმერები არ არიან მთლიანად ავსებენ სამიზნე თანმიმდევრობას, ან პრაიმერები აგრეგირებულია დიმერების შესაქმნელად. მეორე მიზეზი არის ის, რომ Mg2+ იონის კონცენტრაცია ძალიან მაღალია, ანეილირების ტემპერატურა ძალიან დაბალია და PCR ციკლების რაოდენობა ძალიან მაღალია. მეორე ფაქტორი არის ფერმენტის ხარისხი და რაოდენობა. ზოგიერთი წყაროს ფერმენტები ხშირად მიდრეკილია არასპეციფიკური ზოლებისკენ, მაგრამ სხვა წყაროების ფერმენტები არა. ფერმენტების გადაჭარბებულმა რაოდენობამ ზოგჯერ შეიძლება გამოიწვიოს არასპეციფიკური გაძლიერება. კონტრზომები მოიცავს: საჭიროების შემთხვევაში პრაიმერების გადამუშავებას. შეამცირეთ ფერმენტის რაოდენობა ან შეცვალეთ იგი სხვა წყაროთ. შეამცირეთ პრაიმერების რაოდენობა, გაზარდეთ შაბლონის რაოდენობა სათანადოდ და შეამცირეთ ციკლების რაოდენობა. გაზარდეთ დამუშავების ტემპერატურა სათანადოდ ან გამოიყენეთ ორტემპერატურული წერტილის მეთოდი (დენატურაცია 93°C-ზე, ანილირება და გაფართოება დაახლოებით 65°C-ზე).

 

4. ჩნდება ქერცლიანი წევა ან ნაცხი PCR გაძლიერება ზოგჯერ ჩნდება ნაცხის ზოლების, ფურცლის მსგავსი ზოლების ან ხალიჩის მსგავსი ზოლების სახით. მიზეზები ხშირად გამოწვეულია ფერმენტის ჭარბი რაოდენობით ან ფერმენტის ცუდი ხარისხით, dNTP-ის ძალიან მაღალი კონცენტრაციით, Mg2+ კონცენტრაციით, ძალიან დაბალი გამომუშავების ტემპერატურით და ძალიან ბევრი ციკლით. კონტრზომები მოიცავს: ① ფერმენტის რაოდენობის შემცირებას ან ფერმენტის სხვა წყაროს შეცვლას. ②შეამცირეთ dNTP-ის კონცენტრაცია. სათანადოდ შეამცირეთ Mg2+ კონცენტრაცია. გაზარდეთ შაბლონების რაოდენობა და შეამცირეთ ციკლების რაოდენობა