PCR FAQ 1. 偽陰性、増幅バンドが表示されない 2. 偽陽性 3. 非特異的な増幅バンドが表示される 4. 薄片状のドラッグ ストリップまたはスメア ストリップが表示される：

1 偽陰性、増幅バンドが表示されない PCR 反応の重要な側面は次のとおりです。

①鋳型核酸の調製

② プライマーの品質と特異性

③酵素の質と

④ PCR サイクル条件。理由を見つけるには、上記のリンクでも分析と調査を行う必要があります。

テンプレート：

① 鋳型に不純物タンパク質が含まれている

② 鋳型に Taq 酵素阻害剤が含まれている

③ 鋳型内のタンパク質、特に染色体中のヒストンは消化除去されない

④ 鋳型の抽出・調製時に損失しすぎた、またはフェノールを吸入した

⑤鋳型核酸が完全に変性していない。酵素やプライマーの品質が良好であるにもかかわらず、増幅バンドが現れない場合は、検体の消化処理や鋳型核酸の抽出処理に問題がある可能性が高くなります。したがって、効果的で安定した消化溶液を調製する必要があり、その手順は固定されており、自由に変更すべきではありません。 。酵素の不活化: 偽陰性が酵素活性の喪失または不十分によって引き起こされているかどうかを分析するには、新しい酵素を交換するか、新旧の酵素を同時に使用する必要があります。 Taq 酵素を忘れることがあることに注意してください。プライマー: プライマーの品質、プライマー濃度、および 2 つのプライマーの濃度が対称的であるかどうかは、PCR の失敗や増幅バンドが不十分で拡散が容易になる一般的な理由です。一部のバッチではプライマー合成の品質に問題があります。 2 つのプライマーのうち 1 つは高濃度で、もう 1 つは低濃度であるため、非対称増幅の効率が低くなります。

対策は次のとおりです。

① 適切なプライマー合成ユニットを選択します。

② プライマーの濃度は OD 値だけでなく、アガロースゲル電気泳動のプライマー原液にも注意してください。プライマー バンドが存在し、2 つのプライマー バンドの明るさがほぼ同じである必要があります。たとえば、一方のプライマーにはバンドがあり、もう一方のプライマーにはバンドがありません。ストリップの場合、この時点で PCR が失敗する可能性があるため、プライマー合成ユニットとのネゴシエーションを通じて解決する必要があります。一方のプライマーの明度が高く、もう一方のプライマーの明度が低い場合は、プライマーを希釈するときに濃度のバランスを調整してください。

③ プライマーは凍結融解を繰り返したり、冷蔵庫での長期保管はプライマーの変質・変質の原因となりますので、高濃度・少量で保管してください。

④プライマーの長さが足りない、プライマー間にダイマーが形成されるなど、プライマー設計に無理がある。 Mg2+濃度：Mg2+イオン濃度はPCR増幅効率に大きな影響を与える。濃度が高すぎると、PCR 増幅の特異性が低下する可能性があります。濃度が低すぎると、PCR 増幅の収量に影響し、バンドが増幅されずに PCR 増幅が失敗する場合もあります。反応量の変化: 通常、PCR 増幅に使用される量は 20ul、30ul、および 50ul です。 100μl、またはPCR増幅にどの量を使用するかは、科学研究と臨床検査のさまざまな目的に応じて設定されます。 20ul などの少量を作成した後、さらに多くの量を作成する場合は、条件を守らなければ失敗しやすくなります。物理的な理由: 変性は PCR 増幅にとって非常に重要です。変性温度が低く、変性時間が短い場合、偽陰性が発生する可能性が非常に高くなります。アニーリング温度が低すぎると、非特異的増幅が発生し、特異的増幅効率が低下する可能性があります。アニーリング温度が高すぎます。プライマーのテンプレートへの結合に大きな影響を与え、PCR 増幅効率を低下させます。場合によっては、アンプまたは水溶性ポット内の変性、アニーリング、および伸張温度をチェックするために標準温度計を使用する必要があります。これも PCR が失敗する原因の 1 つです。標的配列の変異：標的配列が変異または欠失しており、それがプライマーのテンプレートへの特異的結合に影響を与える場合、または標的配列の特定のセグメントの欠失によりプライマーとテンプレートが相補的配列を失った場合、PCR 増幅は行われません。成功しません。

2.偽陽性 表示される PCR 増幅バンドはターゲット シーケンス バンドと一致しており、場合によってはバンドがより規則的で明るい場合もあります。不適切なプライマー設計: 選択された増幅配列は非標的増幅配列と相同性があるため、PCR 増幅を実行すると、増幅された PCR 産物は非標的配列になります。ターゲット配列が短すぎたり、プライマーが短すぎたりすると、偽陽性が発生しやすくなります。プライマーを再設計する必要があります。標的配列または増幅産物のクロスコンタミネーション: このコンタミネーションには 2 つの理由があります。1 つは、ゲノム全体または大きなフラグメントのクロスコンタミネーションであり、偽陽性を引き起こします。この偽陽性は、次の方法で解決できます。 ターゲット配列がサンプルガンに吸い込まれたり、遠心管から飛び散ったりしないように、操作するときは慎重かつ丁寧に行ってください。酵素や高温に耐えられない物質を除き、すべての試薬や器具は高圧滅菌する必要があります。すべての遠心分離管とサンプル注入ピペットチップは 1 回ずつ使用する必要があります。必要に応じて、検体を添加する前に反応チューブと試薬に紫外線を照射して、存在する核酸を破壊します。 2 つ目は、空気中の核酸の小さな断片の汚染です。これらの小さな断片は標的配列よりも短いですが、一定の相同性を持っています。それらは互いにスプライシングされ、プライマーに相補的になった後、PCR 産物が増幅されて偽陽性が生じる可能性がありますが、これはネステッド PCR 法によって軽減または排除できます。

 

3.非特異的増幅バンドが出現する PCR増幅後に出現するバンドが予想サイズと一致せず、大きいか小さいか、あるいは特異的増幅バンドと非特異的増幅バンドが同時に出現します。非特異的なバンドが現れる理由は次のとおりです。まず、プライマーが標的配列に完全に相補的ではないか、プライマーが凝集してダイマーを形成していることが考えられます。 2 番目の理由は、Mg2+ イオン濃度が高すぎる、アニーリング温度が低すぎる、PCR サイクル数が高すぎることです。 2番目の要素は酵素の質と量です。一部の供給源からの酵素は非特異的なバンドが発生する傾向がありますが、他の供給源からの酵素はそうではありません。酵素の量が多すぎると、非特異的な増幅が発生することがあります。対策としては、必要に応じてプライマーを再設計することが挙げられます。酵素の量を減らすか、別の酵素源に置き換えてください。プライマーの量を減らし、テンプレートの量を適切に増やし、サイクル数を減らします。アニーリング温度を適切に上げるか、2 温度点法 (93°C で変性、65°C 付近でアニーリングと伸長) を使用します。

 

4.薄片状の引きずりまたはスミアが現れる PCR 増幅は、スミア状のバンド、シート状のバンド、またはカーペット状のバンドとして現れることがあります。多くの場合、その理由は、多すぎる酵素または低品質の酵素、高すぎる dNTP 濃度、高すぎる Mg2+ 濃度、低すぎるアニーリング温度、および多すぎるサイクルによって引き起こされます。対策としては、 ① 酵素の量を減らすか、酵素を別のものに置き換える。 ②dNTP濃度を下げる。 Mg2+ 濃度を適切に下げます。テンプレートの量を増やし、サイクル数を減らす